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文|时梦嫣

编辑|时梦嫣

简介

了解氨基酸、肽或蛋白质等生物分子与矿物表面之间的相互作用是目前表面化学、催化和益生元化学领域的一个重要课题。矿物质已被广泛用作非生物聚合的催化剂，并且可以成为研究生物分子的过程。

在这些矿物中，黄铁矿（FeS2）是地球上最重要和最丰富的硫化物矿物之一。一种叫做“铁硫世界”的理论Wächtershäuser提出，导致氨基酸形成的第一个反应并没有发生在海洋中的大量溶液中（益生元汤理论），而是发生在黄铁矿的表面，因为这种表面有可能促进益生元聚合。

最近的分子动力学由晶体结构变化产生的黄铁矿表面可以选择性地结合简单的氨基酸残基。

这些关于黄铁矿上简单氨基酸吸附的理论结果尚未得到实验证明。为了阐明简单益生元分子在黄铁矿表面的吸附机制，必须在分子尺度上研究此类界面的吸附行为。

了解简单氨基酸在黄铁矿表面的吸附将增强我们对肽结合形成蛋白质的方式。

我们旨在研究简单氨基酸吸附在黄铁矿上的亲和力，并通过实验揭示黄铁矿表面对分子键合的影响。

在这项工作中，我们使用拉曼光谱来识别黄铁矿的表面结构，并使用配备液体池的商业AFM系统（MFP-3D，庇护研究公司，圣巴巴拉，加利福尼亚州）研究氨基酸和黄铁矿表面之间的相互作用力分子水平。AFM是执行高精度力测量的强大工具，它允许详细研究分子相互作用，这是其他技术无法实现的。

我们选择研究赖氨酸和其他被认为存在于原始地球上的简单氨基酸。使用成熟的尖端修饰方法将氨基酸分子固定在AFM尖端上，为量力测试做准备。

材料和方法

标称弹簧常数为0.02N/m的商用软悬臂（OMCL-TR400PB-1，双面镀金）用于尖端修改。在AFM探针功能化方法中，首先通过在乙醇中混合两种类型的硫醇试剂引入悬臂：1,8-辛二硫醇(2mM)和6-巯基己烷-1-醇(20mM)超过18小时。

混合溶液用于通过控制尖端上的分子密度以及防止尖端表面上的分子聚集来增加发生单分子事件的可能性。

用乙醇洗涤后，1mg/ml交联剂分子在甲苯中N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-马来酰亚胺（MAL-PEGn-NHS，n=24，Mw=1340，购自QuantaBioDesign,Ltd.,Boston,MA)通过其马来酰亚胺末端与链烷硫醇的-SH反应形成稳定的共价键，锚定到尖端60分钟。然后将它们用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤数次以去除未反应的交联剂。

之后，通过在室温下将尖端浸入PBS(pH=7.4)中的1mM氨基酸溶液中2小时，将氨基酸残基通过PEG交联剂分子的游离NHS末端与尖端交联.最后，再次用PBS清洗修改后的尖端以去除未结合的分子以进行力测量。

在固定赖氨酸的情况下，它包含“ε”和“α”氨基。基本上，PEG交联剂的NHS反应基团应与两个氨基反应。然而，我们假设epsilon氨基具有比α氨基(pKa=9)更高的pKa值(pKa=10.5)，后者通常参与氢键，并且在缓冲溶液中会解离epsilon氨基，但不是α胺。因此，α胺应与PEG交联剂的NHS基团反应。

样品制备

在我们的实验中使用了市售天然黄铁矿（Navajun，西班牙）的单晶立方体(100)。使用LabCutter设备(MC-120,Maruto)将这种矿物切成小片(1cm×1cm)用于拉曼和AFM实验。切割后，将基板清洗干净：

图1

氨基酸残基修饰的AFM针尖示意图。标称半径为~20nm的镀金原子力显微镜尖端通过MAL-PEGn-NHS交联剂被氨基酸分子化学修饰。马来酰亚胺基团与巯基反应形成稳定的硫醚键。N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基团在pH=7-9时与N-末端氨基发生特异性反应，形成稳定的酰胺键。

图2

天然黄铁矿图像（西班牙Navajun），黄铁矿基板切割后的图像以及黄铁矿最外表面的光学显微镜图像显示单晶面的阶梯状结构。

在乙醇溶液和去离子水中进行超声处理以去除表面的污染物。光学显微镜显示了我们实验中使用的黄铁矿最外表面的阶梯状结构。

天然黄铁矿表面的拉曼光谱表征

我们首先对天然黄铁矿的单晶立方体进行了拉曼光谱分析，以确定表面上不同的晶体结构位点。之后，在黄铁矿表面进行力测量。黄铁矿表面的光学反射图像，显示了台阶边缘、梯田和扭结。

使用532nm激光线进行激发，测量拉曼光谱。实验揭示了大约345cm-1和380cm-1处的两个主峰，这分别归因于硫哑铃的振动(Eg)和拉伸(Ag)模式~435cm-1处的小峰对应于拉伸和振动模式(Tg)的组合。

拉曼测量在图中B指示的不同位置进行，以检查结果的可靠性。我们观察到与位置A测量的三种模式相同的光谱。但是，位置A和B的两个光谱之间存在相当大的差异，特别是在它们的Ag模式峰的频率、强度和宽度方面。

在位置B，与位置A处的相应峰相比，Ag模式峰的频率较低且宽度变宽。强度Ag模式峰在位置B处显著降低。

增加的键长可能特别归因于硫原子从表面的解吸，表明存在非化学计量的黄铁矿(FeS2−x)。在这种情况下，我们进行了热解吸光谱(TDS)来检查硫原子从黄铁矿表面的解吸，结果就是硫原子优先从黄铁矿表面解吸，表明硫空位是黄铁矿固有的。

图3

黄铁矿外表面的光学显微镜图像。样品表面的台阶边缘、平台和扭结用箭头标记；

光学图像中A点表示的黄铁矿外表面的拉曼光谱：

图4

黄铁矿外表面的光学显微镜图像；在位置A和B处测量的黄铁矿外表面的拉曼光谱。观察到两个光谱之间存在相当大的差异，特别是在其Ag模式峰的频率、强度和宽度方面。

一般力测量

通过拉曼测量确定黄铁矿上非化学计量位点的存在后，我们打算使用AFM研究氨基酸的吸附行为。所有力测量均在室温下在PBS溶液(pH=7.4)中进行，以最大限度地减少探针与底物之间的非特异性相互作用。

通过将每个修改后的AFM尖端降低到测量表面上至400pN的最大负载，用至少两个氨基酸修饰的AFM尖端记录了数百条力-距离(FD)曲线。

赖氨酸对黄铁矿的力测量

在6nN/s的加载速率下观察到具有中等频率的特定粘附事件。特定的粘附事件可以通过在氨基酸残基从表面脱离后栓系交联剂的典型延伸来识别。延伸长度（交联聚合物最大物理可能延伸的长度）范围从大约15到25nm。

考虑到用于将氨基酸分子安装在尖端上的分子的总长度，该范围是合理的。由于氨基酸残基的分子长度太小，大部分延伸一定是由接头分子引起的，它可能已经延伸到大约12-15nm的总长度。

交联剂N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-马来酰亚胺(NHS-PEG-MAL)的标准延伸长度为~10nm，短硫醇分子为~2nm。然而，延伸长度会有所不同，因为分子可以以不同的构象存在，这很难控制。

为了检验实验结果的可靠性，垂直显示了至少三个不同功能化尖端中的几条力曲线。此外，这些实验中记录的粘附力范围从大约100到300pN，并且10%的特定粘附事件来自数百(~600)FD曲线。这种低粘附概率提供了证据，表明确实测量了与底物的单分子相互作用。

图5

赖氨酸和黄铁矿之间的力测量。在黄铁矿表面用赖氨酸修饰的AFM针尖的典型单分子FD曲线。在AFM探针缩回过程中，特定的粘附事件很明显；红色和蓝色迹线分别表示接近表面和从表面缩回时的信号：

图6

在黄铁矿上用赖氨酸修饰的AFM尖端缩回期间的典型FD曲线垂直显示。这些力曲线是由三个不同的功能化尖端产生的，具有相同的6nN/s加载速率；解除约束力直方图。加载速率为6nN/s(pH=7.4)时黄铁矿表面赖氨酸的MPF。使用高斯拟合计算平均粘附力，显示平均值为123.5pN

对于黄铁矿，我们通过绘制事件数与破裂力的关系来构建直方图。应用于直方图的高斯拟合表示平均粘附力，称为最可能的力(MPF)。给定的直方图中仅包含显示合理范围(10-30nm)扩展长度的破裂事件。

云母上赖氨酸的力测量

我们进一步研究了赖氨酸和云母之间的相互作用作为参考实验，并且当使用用于黄铁矿底物的相同改良尖端时没有观察到相互作用。在相同条件下以6nN/s的加载速率在PBS溶液(pH7.4)中进行测量。

本实验中测得的粘附事件确实源于氨基酸分子与黄铁矿表面之间的相互作用，而不是源于底物与未成功修饰的尖端之间的相互作用。

我们还可以观察到其他氨基酸在黄铁矿表面的特异性吸附。我们选择研究含硫氨基酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。测量在PBS溶液(pH7.4)中以6nN/s的加载速率进行。

在粘附力范围(120-200pN)中观察到赖氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸之间没有太大差异。结果与我们的TDS测量结果一致，其中氨基酸显示化学吸附峰。

TDS测量

在TDS实验中，将黄铁矿浸入100mM氨基酸溶液中一天。之后，基板在小于10-5Pa的条件下以10˚C/min的速度从50˚C加热到350˚C。

图7

在云母表面用赖氨酸修饰的AFM针尖的典型FD曲线。红色和蓝色迹线分别表示接近表面和从表面缩回时的信号：

图8

用甲硫氨酸和半胱氨酸黄铁矿表面修饰的AFM尖端的特定粘附力曲线。红色和蓝色迹线分别表示接近表面和从表面缩回时的信号：

图9

甘氨酸的TDS光谱；赖氨酸；半胱氨酸；黄铁矿上的甲硫氨酸(pH=7.4)。第一峰和第二峰分别表示物理吸附和化学吸附。

吸附（物理吸附），而第二个峰是指强烈的化学吸附（化学吸附）。在甘氨酸峰旁边，出现了赖氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的两个峰，表明分子在表面上存在强烈的化学吸附。

讨论

由于黄铁矿电子结构的变化而产生的硫空位导致分子式FeS2−x的非化学计量位点的存在增强了氨基的化学反应性和缩合黄铁矿表面的酸。因此，黄铁矿表面在黄铁矿的Fe2+和氨基酸的COOH-基团之间提供了更高的化学键合可能性。除了这个理论假设之外，值得注意的是YairRazvag等人。

研究了几种氨基酸在无机物表面的吸附，提出疏水力主导氨基酸和无机基质之间的粘附。氨基酸残基的性质（疏水性或带电荷）。与其在特定环境条件下，无机底物表面化学性质之间的相互作用，控制着氨基酸之间相互作用的强度和表面。

这一结论与我们选择研究甘氨酸和其他氨基酸时的假设通常并不矛盾。这是因为没有任何侧链的甘氨酸在力测量中没有表现出特异性粘附，在TDS测量中也没有化学吸附。

我们假设甘氨酸可能通过物理吸附吸附到黄铁矿表面，分子之间没有化学键合，这是指我们的AFM实验，其中没有观察到特定事件。那些带有侧链的氨基酸（赖氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸）在TDS实验中表现出化学吸附，这在AFM实验中也通过特异性相互作用得到证明。

此外，根据之前的许多报道，含硫氨基酸吸附在黄铁矿上。例如，JARojas-Chapana等人通过实验验证了半胱氨酸和甲硫氨酸与黄铁矿的铁和硫物质的复合形成以及FeS-R和FeS-SR桥的形成。

我们假设氨基酸侧链的特征，即其电荷（负或正）和极性（极性或非极性）可能影响吸附及其与黄铁矿的相互作用（或不相互作用）。

这些氨基酸如何吸附到黄铁矿表面的确切机制仍在讨论中，建议对黄铁矿表面的各种氨基酸。在不同pH值和溶液离子强度下可能影响吸附的情况进行更系统的研究底物的残留物。

矿物质在生命起源前化学过程中可能发挥的作用，从而进一步丰富矿物质-生物分子相互作用的完整知识，这对于评估其在生物技术应用中的使用至关重要。

参考文献：

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Flotation of auriferous arsenopyrite from pyrite using thionocarbamate. Forson P.,Zanin M.,Abaka-Wood G.,Skinner W.,Asamoah R.K.. Minerals Engineering.

Selective separation of chalcopyrite from pyrite using an acetylacetone-based lime-free process. Wu Sihui,Wang Jianjun,Tao Liming,Fan Ruihua,Wang Cong,Sun Wei,Gao Zhiyong. Minerals Engineering.

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