迄今为止最灵敏！观测单个分子，登上Nature！

在这里， 威斯康星大学麦迪逊分校 Randall H. Goldsmith教授 课题组 利用 基于高精细光纤的法布里-佩罗特微腔（FFPC）中增强的光-分子相互作用来 检测单个生物分子 ，该技术能够 以前所未有的信噪比检测小至1.2 kDa的溶液相生物分子，并解析其扩散行为 。这一技术成就， 标志着在没有荧光标记帮助的情况下观察单个分子的新兴领域的重大进展 。相关成果以“Label-free detection and profiling of individual solution-phase molecules”为题发表在 《Nature》 上。

FFPC 由两根单模光纤组装而成，光纤端面为激光照射的凹面，随后涂上高反射率电介质层。光纤镜面被对准并横向固定在一个切割好的熔融石英套圈内（图 1a，b），以增加被动机械稳定性。在监测反射和透射的同时，使用 660-760 nm 波长的静态频率激光对光学模式进行了检测（图 1a）。镜面间距约为 20 μm（图 1b）。 在不依赖质子增强机制表面邻近性或表面支持对接分子的构象或化学变化的情况下，对于分子量相当的分子，作者展示的信噪比比现有的无标记生物分子传感技术高出 42 倍。此方法的质量检测限也比直接质量光度法小 25 倍左右，与机器学习质量光度法相比，检测限小 8 倍，信噪比高 70 倍左右。

图1：测量设备及共振扫描

绘制时间参数和强度参数的分布图可获得二维信号剖面图，其中包含有关分子质量和扩散的独特信息（图 2b）。每个蛋白质分子都表现出时间宽度的分布，时间宽度可从明显高于噪声的事件的半最大值全宽（FWHM）和随着蛋白质分子量增加而增加的突起中识别（图 2b）。为了证明该技术超越检测的能力，作者通过计算包含多个单独检测到的分子的时间轨迹的自相关函数，从数据中提取时间信息，从而探索了属性检测的潜力。 与其他无标记单分子方法相比，此方法还能量化小于 50 倍的分子的扩散行为。 对于质量越来越大的蛋白质来说，自相关性会在更长的时间尺度上显示出动态变化（图 3a）。值得注意的是，自相关时间始终与蛋白质半径成线性关系（图 3b）。这一结果证实了这种新的单分子技术作为分子特性检测的多功能性，展示了提取有意义的分子信息的潜力。评估分子动力学的无标记方法可对生物物理应用产生重大影响。

图2：来自单个分子的信号

图 3：单分子分布的扩散信息

作者研究了阿普罗宁和 Myc-tag 的混合物，它们的质量为 5.3 kDa，半径相差 0.7 nm（图 4a）。混合物的等高线图与纯成分分布的总和在性质上非常相似。虽然仅考虑峰值突出度很难分辨这两个群体，但在二维等值线图中可以清楚地看到两个不同的群体，一个是平均事件 FWHM 为 0.49 ± 0.15 毫秒的快速移动群体，另一个是平均事件 FWHM 为 1.68 ± 1.37 毫秒的较宽的慢速移动群体。除了蛋白质样本之外，作者还探索了质量（16.6 kDa）和组成相同但序列不同的 DNA 异构体双分子混合物的分辨率（图 4b）：DNA 双链（9 nm）和 Y 结结构（5 nm）。在二维等值线图中，这两个种群沿任一单独轴线都能清晰分辨，而且在整个实验过程中，这两种成分都存在。在已知的纯 DNA 样品中进行加标，可以确定较大的突起群来自 Y 接合点。

图4：混合物的分辨率

讨论

将FFPC安装在玻璃套管中并使用PDH锁定可以提供极大的稳定性，将机械和激光频率噪声抑制到探测器极限水平（图5a）。PDH锁定带宽（LBW）只能抑制低于5 kHz的波动，包括分子波动，这时低频机械波动会引起显著共振偏移。较大的缓慢移动分子的扰动也会被抑制，而小分子的布朗运动虽然共振偏移较小，但其均方位移功率谱密度大部分在PDH抑制范围之外。对于最小的蛋白质（Myc-tag, 0.75 nm），在LBW结束和光热带宽之间的均方根位移为93 nm，与节点和反节点间的250 nm距离相当，表明分子在PDH带宽外可以导致显著共振偏移。当分子回到节点时，扰动停止，系统依赖于分子扩散常数。通过从节点到反节点的位移检测不同于以往模式，无标记的液相装置允许PDH作为高通滤波器，减少机械噪声，同时传递快速移动分子的信号。光热引起的共振线形变形和动态光热预处理机制放大了小的共振偏移，FFPCs内强烈的光场引起温度变化和热光共振偏移。实验确定光热带宽为21 kHz，定义了分子观察窗口的上限。非PDH稳定的腔中，这些光热非线性导致多个稳定平衡态，但在PDH稳定下可进一步放大信号。通过增加腔传输使泵浦激光频率略低于腔最大值，在预处理状态下，扩散分子的共振偏移可引发腔体冷却过程，导致传输下降。分子扩散出反节点后，腔体升温，PDH恢复初始位置。PDH输出伺服添加的电压脉冲实验模拟了分子通过的内部扰动，证实了这种机制。

图5：空腔增强单分子检测机制

小结

本研究展示了在无表面、无外在标签和无等离子体增强的条件下，观测单个扩散生物分子的超高灵敏度，对小于1 nm的肽实现了超过100的信噪比。 作者利用微型FFPC的开放几何结构，促进了生物分子自由扩散并最大化其与光场的重叠。通过分子速度过滤和光热预处理，将快速分子运动和热非线性转化为优势，实现了相对其他无标记技术的增强灵敏度。获得的丰富2D强度/时间数据可以区分独特的分子特征，并提供定量的质量和扩散信息。 相比于已商业化的质量显微术， FFPC方法避免了表面干扰，提供了微秒级动态和更高的灵敏度，检测限低至1 kDa，并通过2D信号区分分子的构象和质量。FFPC便于光纤集成，分子通过后可以用质量显微术进一步检测，形成互补。尽管目前方法存在信号非线性等限制，但未来的实验改进和噪声抑制预期将显著提升灵敏度。作者的FFPC方法有潜力解析快速生物分子构象变化、自组装过程，并快速筛选蛋白质相互作用。作为无标记单分子方法，它能缓解FCS和动态光散射中的关键实验难题，广泛应用于生命和化学科学领域。