介入文献第18期——免疫治疗与肺癌的引流淋巴结

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标题是《Multi-scale characterization of tumor-draining lymph nodes in resectable lung cancer treated with neoadjuvant immune checkpoint inhibitors》

《接受新辅助免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗的可切除肺癌患者引流淋巴结的多尺度特征》

通讯作者姚烽，来自上海市胸科医院（上海交通大学附属胸科医院）胸外科。

Summary

Background：

区域淋巴结(LN)是抗肿瘤免疫的重要器官。矛盾的是，肿瘤引流淋巴结(TDLNs)又通常是肺癌肿瘤转移的第一个部位。在肺癌患者中，TDLNs的状态与原发瘤床对免疫检查点抑制剂(ici)的反应之间的关系尚不清楚。此外，关于TDLNs对ici的应答特征的研究很少。

Methods：

回顾性分析68例接受新辅助ici联合手术治疗的肺癌患者的临床资料，描述、比较其原发瘤床和TDLNs的影像学、18F-FDG代谢和病理反应。此外，我们使用多重免疫荧光技术对TDLNs内免疫和非免疫细胞的空间分布进行了研究，分别研究原发肺肿瘤床和对应TDLNs的治疗反应(如病理完全缓解(pCR)或主要病理缓解(MPR))。

（pCR：在手术切除的原发肿瘤样本和所有采样的区域淋巴结中已经没有任何肿瘤细胞残留。

MPR：手术切除的原发肿瘤样本中残留的肿瘤细胞≤10%。）

Findings：

我们观察到，在影像学、代谢(18F-FDG摄取)和病理改变方面，TDLNs对ICIS的反应与其配对的原发肺肿瘤明显不同。新辅助ICIS治疗特异性地降低了具有pCR/MPR的原发肿瘤床中18F-FDG反映的代谢活性，但不降低其TDLNs对应的代谢活性。此外，在其原发肿瘤床中，侵袭性TDLNs的存在与较差的病理反应相关，并预示着治疗后肿瘤的快速复发。Spatial profiling显示在侵袭的TDLNs转移灶内未见T细胞浸润，并且转移灶周围非受累区域的多种免疫和非免疫成分减少。

Interpretation：

这些结果提供了首个临床相关的证据，证明了在ICIs治疗下TDLNs独特反应的模式，并揭示TDLNs状态与其原发肿瘤对ICIs的反应在肺癌治疗中的相关性被低估了。

Research in context研究背景

Evidence before this study本研究之前的证据：

免疫治疗深刻改变了肺癌患者的治疗模式。然而，肿瘤细胞对治疗的反应存在异质性，这种异质性可能由肿瘤细胞自身或肿瘤微环境等多种因素引起。

虽然已经确定了大量生物标志物来对可能从免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗中获益的患者进行分层，但它们的表现因患者而异。

因此，了解肿瘤逃避免疫监视的病理生物学和阐明药物作用机制，最终促进个体化治疗仍是越来越必要的。

长期以来，区域引流淋巴结(LN)被认为是抗肿瘤免疫的重要器官，富含多种免疫成分。

最近的证据也表明，肿瘤引流淋巴结(TDLNs)是肿瘤特异性T细胞的储存库，驱动它们浸润到原发肿瘤中。

然而，TDLNs常作为肺癌转移的首个部位。促进癌细胞适应TDLNs内免疫功能良好的微环境的潜在分子机制仍有待探索。

特别是在肺癌患者中，TDLNs状态(无瘤vs.有瘤侵袭)对原发肿瘤对ici治疗反应的影响目前仍不清楚。

此外，目前还缺乏在ici治疗背景下，对比侵袭和相匹配的非侵袭TDLNs之间免疫和非免疫成分的空间特征的研究。

Added value of this study 本研究的价值：

新辅助ICIs治疗后再进行手术，为同时评估原发肿瘤及相应TDLNs对ICIs的疗效提供了理想的条件。

基于接受新辅助ici加手术的肺癌患者的临床队列，我们首先描述并比较了反应良好和反应不良患者的临床病理特征。

值得注意的是，我们的研究表明，对新辅助ICIs治疗反应不佳的病例大多与更多的肿瘤浸润的TDLNs相关，并且浸润的TDLNs被确定为预测配对原发肿瘤治疗反应的唯一独立生物标志物。

这表明，尽管在ICIs治疗下被激活，侵袭的TDLNs仍可能产生抑制的抗肿瘤免疫。更重要的是，侵袭TDLNs的存在预示着新辅助ICIs治疗后肿瘤的快速复发，提示侵袭TDLNs内的残留肿瘤细胞可能代表了一个特殊的亚群，不仅能够逃避免疫监视和抵抗ICIs治疗，而且是肿瘤复发的重要来源。

此外，空间分析揭示了侵袭和匹配的非侵袭TDLNs之间的免疫和非免疫成分的显著差异，为与侵袭TDLNs相关的疗效降低提供了一定的解释。

Implications of all the available evidence所有现存证据的意义：

我们的研究结果强调了转移性TDLNs的存在，它是一种以前未被充分认识的生物标志物，可预测ICIs应答，并且是ICIs治疗失败的潜在关键来源，这提高了我们对TDLN介导的局部免疫对有效免疫治疗的重要性的认识。

特别是，这可能有助于指导临床改进免疫疗法的合理化设计。

例如，系统性/非选择性切除TDLNs是肺癌外科治疗的常规选择。但是，我们的研究结果支持精确/选择性地切除受侵犯的TDLNs，同时保留未受侵犯的TDLNs，以提高后续ICIs辅助治疗的疗效，因为TDLNs是抗肿瘤免疫和对ici产生有效反应的关键部位。以TDLNs为导向的局部治疗联合系统性ICIs可能提供更大的治疗获益。

Introduction

免疫检查点抑制剂(ICIs)极大地改变了包括肺癌在内的各种晚期癌症的治疗。

最近的证据也强调了在可切除肺癌中，新辅助ici联合手术的前景。

然而，临床证据表明，接受ICIs的患者的应答存在异质性，并且原发性或继发性治疗耐药常见。这表明我们迫切需要了解免疫治疗失败的病理生物学基础，以指导临床更好地应用ICIs。

细胞毒性T细胞是抗肿瘤免疫反应的基本效应细胞，是有效的肿瘤免疫治疗的支柱。

之前，ICIs被认为是通过直接激活肿瘤微环境中预先存在的耗竭的CD8+ T细胞来发挥作用。然而，新的证据强调了肿瘤微环境外新启动和扩增的效应T细胞的重要性，这些细胞在介导抗肿瘤反应中起关键作用。

最关键的来源之一是区域肿瘤引流淋巴结(TDLNs)，该淋巴结高度富集T细胞和其他免疫成分，并在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。

具体而言，抗原呈递细胞(如树突状细胞)捕获原发肿瘤组织中的肿瘤抗原，然后迁移至TDLNs，随后T细胞在TDLNs中被激发。最终，活化的T细胞浸润到原发肿瘤部位并介导肿瘤根除。

越来越多的证据表明TDLNs中各种成分对ICIs疗效的重要性，包括TDLNs中的免疫细胞和非免疫细胞，然而，这主要是基于其他癌症类型的实验室小鼠模型，缺乏关于肺癌的临床证据。此外，这些基础研究大多集中在肿瘤未受累的TDLNs，而受累的TDLNs对肿瘤免疫的影响仍有待确定。

肺是一个高度免疫的器官，富含多个引流淋巴结。矛盾的是，在手术切除的肺癌病例中，尽管没有可检测到的远处扩散，但在肉眼或显微镜下仍观察到肿瘤细胞转移到TDLNs，转移性TDLN的存在也被认为是一个强烈的不良预后因素。

无论先前的临床前模型还是最近的基于单细胞的谱系追踪分析都支持局部淋巴系统是肺癌在远处转移之前的早期转移途径。这些现象似乎对TDLN的经典抗肿瘤功能发出了挑战。

此外，在实验模型中，最近的证据也表明TDLNs在肿瘤进展中具有促进肿瘤的作用。

这些观察表明，TDLNs在肿瘤发病机制中执行复杂且看似矛盾的功能。

因此，TDLNs在塑造肿瘤免疫中的作用值得进一步研究，特别是在ICIS治疗的情况下，其疗效与TDLNs内的免疫和非免疫细胞密切相关。

原发瘤床的病理完全缓解(pCR)或主要病理缓解(MPR)是一个被广泛接受的替代指标，可用于新辅助ICIs治疗后肺癌患者的治疗获益和生存预测。

然而，TDLNs的治疗应答尚未明确。特别是侵袭/转移的TDLNs(称为TDLNs+)的存在是否影响原发肿瘤床的治疗反应仍不清楚。

因此，在本研究中，为了确定和比较原发肿瘤和其配对的TDLNs的治疗反应，以及揭示TDLNs在介导ICIs治疗效果中的潜在生物学作用，我们分别明确和比较了接受新辅助ICIs联合手术的局部晚期肺癌患者的原发肿瘤床和其配对的TDLNs的治疗反应。有趣的是，我们观察到原发瘤床和它们配对的TDLNs在影像学大小、代谢活性和病理反应方面有显著不同的反应模式。

值得注意的是，在原发肿瘤床中，TDLNs+的存在独立预测了ICIs的不良反应，更多的TDLNs+与更高的治疗反应不良频率相关。

使用多重免疫荧光(mIF)染色的空间分析揭示了TDLNs阳性和其配对的未受侵犯的TDLNs(称为TDLNs-)之间的免疫和非免疫区室的差异。

综上所述，我们的数据揭示了TDLNs在ICIs治疗下的独特反应模式，并揭示了TDLNs状态与新辅助ICIs治疗反应之间的关系，这可能有助于我们的治疗决策。

Methods

Study design and patients：

收集接受新辅助免疫治疗或化学-免疫治疗后行手术治疗的局部晚期非小细胞肺癌(NSCLC) [TxN1-3M0或T3-4NxM0 (x表示任意分期)]患者的临床病理资料。研究设计如图1。

纳入接受新辅助免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗后行手术治疗的局部晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者。

分别分析原发灶大小、18F-FDG PET-CT代谢活性及病理缓解程度。

根据TDLNs的病理状态将其分为两组:TDLNs有残留肿瘤细胞(转移;TDLN+)和无瘤TDLN (TDLN-)。

比较TDLNs+与TDLNs-阴性组的多参数差异。

影像学和代谢活性测量：

异常TDLNs定义为治疗前经病理证实有区域淋巴结转移(N=28)，或影像怀疑有区域淋巴结转移【淋巴结肿大(最短直径＞10 mm)和/或治疗前18F-FDG PET-CT (SUVmax)升高】。如果存在多个可疑转移的TDLNs，则以两个最大的TDLNs的最短径或SUVmax比较治疗前后肿瘤大小或代谢的变化。

手术及TDLNs解剖：

新辅助治疗结束后，首选在末次治疗后2周行18F-FDG PET-CT或全身检查，以评估疗效和可切除性。

接着，未出现疾病进展的患者接受手术，因为影像学评估不能很好地反映ICIs后的真实病理缓解情况。

后外侧开胸(开放)或辅助胸腔镜手术(VATS)联合系统性淋巴结清扫，常规涵盖N1 (≥3站)和N2 (≥3站)。

N1指淋巴结转移至支气管周围或同侧肺门淋巴结;N2代表淋巴结转移到同侧纵隔淋巴结和/或隆突下淋巴结。

根据美国癌症联合委员会(AJCC)第8版肺癌分期标准对患者进行临床和病理分期。

根据ICIs治疗后是否存在转移性肿瘤细胞，将TDLNs状态分为TDLNs+或TDLNs-。

在MDT讨论后，所有患者均接受术后辅助免疫治疗或免疫化疗。

吸烟与PD-L1亚组：

累积吸烟暴露量是按吸烟年数乘以平均每天包数来计算。

根据吸烟年限，参与者被分为从不吸烟者(0.0包年)、轻中度吸烟者(0.1~40.0包年)和重度吸烟者(>40包年)。

在新辅助免疫治疗前，由资深的病理医生根据程序性死亡配体1(PD-L1)肿瘤比例评分(TPS)对临床记录中的肿瘤PD-L1表达进行评估，并将样本分为3个亚组：高(≥50%)、中(1-50%)和低(<1%)PD-L1。

治疗反应评估：

回顾临床记录，根据实体肿瘤反应评估标准(RECIST；版本1.1)对新辅助治疗反应进行评估。值得注意的是，在这项研究中，为了分析TDLNs状态对原发肿瘤床(“肿瘤床”是指治疗前肿瘤最初所在的区域)对新辅助ICIS的治疗反应的影响，我们分别分析了原发肺肿瘤床和成对TDLNs的病理反应，因为在淋巴结转移中，由于背景淋巴细胞的原因，通常很难评估肿瘤间质炎症。

总的来说，pCR指的是手术切除的原发肿瘤中没有存活的肿瘤细胞(ypT0NxM0)；MPR被定义为手术切除的原发肿瘤中10%或更少的存活肿瘤细胞。原发肿瘤和TDLN的pCR/MPR分别称为PCR-P/MPR-P和PCR-LN/MPR-LN。

组织病理学评价：

组织病理学数据从临床记录中检索。此外，在未知患者治疗和结果情况下，由一位资深病理学家回顾原发肿瘤石蜡包埋切片和成对TDLNs的苏木精-伊红(H&E)染色切片，然后确定最终的组织病理学评估。

关于原发肿瘤床的组织病理学检查，对肿瘤床的多个部分(包括最长直径)进行了完全抽样。在本研究中，每个样本的肿瘤载玻片数量从4到7个不等，这取决于残留肿瘤的大小。

通常，如果肿瘤体积较小(<3 cm)，则使用几乎覆盖整个原发肿瘤的5-7张切片(中位数：6)进行组织学检查，因为这种小尺寸与新辅助治疗后肿瘤显著缩小和较少的肿瘤残留(良好反应)有关，因此需要仔细检查。

对于肿瘤体积较大(≥3 cm)的肿瘤，通常与新辅助治疗后肿瘤细胞残留较多(反应较差)有关，用较少的载玻片(中位数：5)很容易检测到残留的肿瘤细胞。

如果TDLNs最大直径小于1.0 cm，则彻底检查TDLNs；淋巴结切片数为3~5个。

原发肿瘤反应的评估如前所述：残存肿瘤的百分比=存活肿瘤面积/总肿瘤床面积，即总肿瘤床=残留存活肿瘤+消退床+坏死。

多重免疫荧光染色，图像采集和数据量化：

对于HE切片和普通IHC切片，使用Grundium ocus显微镜扫描仪。使用QuPath开源软件(0.3.2版)自动分析和量化全组织切片图像中癌细胞和间质细胞的染色强度，其中提取每个切片的染色标记的DAB通道强度(根据其细胞内位置的膜、胞浆或核的OD值)。对于癌细胞、间质细胞和坏死性下垂的分类，首先标注代表癌症和间质细胞的典型形态以及坏死性下垂区域的多个训练区域。在此基础上，生成每种细胞类型的唯一参数，然后将其应用于整个载玻片图像。

对于多路IF，载玻片是使用Pannorama MIDI扫描和成像的，使用QuPath开源软件(版本0.3.2)进行批量分析，用于如前所述的阳性染色细胞的定量。因此，我们能够用一个或多个组合标记对阳性染色的细胞进行量化。如上所述，我们知道有多少细胞单一(例如，仅CD8+)、双重(例如，PD1+CD8+)或三重(例如，CD19+CD11c+CD21+)染色阳性。在本研究的空间染色分析中，我们从6例LUSC患者中选择TDLN+和配对TDLN-，包括pCR(n=2)、MPR(n=2)和非pCR/MPR(n=2)。值得注意的是，在病例选择中，我们排除了几乎完全被转移的肿瘤细胞占据的TDLNs，因为在邻近的淋巴结区没有足够的材料来分析。

随访、事件定义和生存时间分析：

在出院后4周开始首次随访。辅助治疗通常在术后1个月开始。之后，每3个月进行一次随访。通过电话或门诊复诊记录向患者获取信息。本研究所有患者均未失访。

生存时间的定义为从手术切除原发肿瘤之日至事件发生(肿瘤复发或患者死亡)或最后一次随访日期(2022年3月底)的时间。截至末次随访时未发生上述事件的患者生存时间定义为删失。具体而言，无进展生存期(RFS)定义为从手术当天到因任何原因发现肿瘤复发或最后随访日期的时间间隔。总生存期(OS)定义为手术日至任何原因死亡或末次随访日期的间隔时间。

Result

新辅助ICIs原发肿瘤床和配对TDLNs之间的影像学差异：

本研究共纳入68例接受新辅助免疫治疗或免疫化疗后联合手术治疗的局部晚期非小细胞肺癌患者。

临床病理特征见表1。

其中32例在ICIs后经病理证实TDLNs有残留肿瘤细胞。其余36例为无瘤TDLNs (TDLNs-组)。

本研究中切除的TDLN中位站数为7 (≥3个N1站和≥3个N2站)，平均每例覆盖15.8个节点。在TDLNs阳性的病例中，N1和N2淋巴结均有肿瘤细胞残留者占53.1%(17 / 32)，其次为仅N1淋巴结受累者10例，仅N2淋巴结受累者5例。

通过对比治疗前后的影像学表现，分析新辅助ICIs治疗后原发瘤床及配对TDLNs的反应模式。结果显示，新辅助ICIs治疗后原发瘤床的影像学大小明显缩小，且与原发瘤床的治疗反应程度和TDLNs的病理状态无关。

与原发肿瘤床相反，新辅助ICIs治疗总体上与异常TDLNs的影像学尺寸显著增大相关。有趣的是，亚组分析表明，增大主要存在于MPR/pCR-p患者中，而不是非MPR/pCR-P患者中。

这些观察结果表明，原发性肿瘤床大小的影像学改变不能很好地区分病理学良好反应者(MPR/pCR-P)和不良反应者，这与以前的证据一致，表明在肺肿瘤中对ICIs反应的影像引导和病理学评估之间存在不一致。

值得注意的是，观察到的新辅助ICIs治疗后异常TDLNs大小的增加主要发生在MPR-P/pCR-P患者中。

这驳斥了将TDLNs的影像学大小变化作为判断ICI治疗反应的参数的可行性，该参数通常是基于广泛使用的RECIST (v1.1)标准来评估治疗反应。

相反，新辅助ICIs治疗后异常TDLNs增大的假性进展可能与ICIs在原发肿瘤中更好的治疗效果相关，这需要进一步验证。

原发性肺肿瘤床和配对的TDLNs对新辅助ICIs治疗表现出不同的代谢反应：

在本研究中，我们分析了12例治疗前后PET-CT数据匹配的患者的原发瘤床及其配对的TDLNs的代谢变化。

有趣的是，我们观察到在MPR/pCR-P组中18F-FDG摄取显著下降(由SUVmax值表示)，而在非MPR/pCR-P组中没有。

根据TDLN状态进行的亚组分析显示，TDLN-亚组与配对原发瘤床的代谢活性显著降低相关，而在TDLN+亚组中未观察到这一现象。

关于TDLNs，我们观察到新辅助ICI治疗导致TDLNs-的代谢活性显著下降，但在TDLNs+亚组中没有。

此外，TDLNs代谢活性的变化与其配对的原发性肿瘤床的病理反应无关。值得注意的是，在一些原发性肿瘤床有pCR或MPR的病例中，ICI治疗后成对TDLNs的代谢活性显著增加。

这些证据表明TDLNs和它们配对的原发肿瘤床对ICIs治疗的反应差异很大。特别是，TDLNs的无瘤状态，即TDLNs-，似乎对它们配对的原发性肿瘤对ICIs的代谢反应具有显著和积极的影响。

在其他一些病例中，只有ICIs前或ICIs后的PET-CT数据。整合这些数据并分别分析原发瘤床或异常TDLNs中，ICIs前后的SUVmax值与病理反应的相关性。有趣的是，分析显示MPR/pCR-P事件仅与治疗后原发瘤床的SUVmax显著相关，而与治疗前无显著相关。并且也与TDLNs状态无关。

这些结果强调了原发性肿瘤床的ICIs后生存最大值是病理反应程度的潜在指标。在本研究人群中，区分MPR/ pCR-P和非MPR/pCR-P的ICIs后SUVmax的最佳临界值为11.5(敏感性:0.83；特异性:0.90)，这需要进一步的大样本研究。

总之，新辅助ICIs在原发肿瘤和配对TDLNs之间诱导不同的影像学和代谢变化，这也对肺癌原发病灶的治疗反应有明显的影响。

TDLNs阳性的患者对新辅助ICIs的反应较差：

与TDLNs-组相比，TDLNs+组女性患者比例更高，治疗前PD-L1高表达(TPS＞ 50%)的比例更低，ICIs治疗反应更差(pCR/MPR-P发生率更低，non-pCR/MPR-P发生率更高)。

新近的生物学实验证据证实，TDLN和免疫反应在配对的原发肿瘤中是相互作用的。

调整混杂因素后(年龄、吸烟、临床分期、切除类型和手术方式)，采用cox比例风险回归模型进行多因素分析。根据DAG，多变量logistic回归分析发现，pCR/MPR-P的发生与显著较低的TDLNs+事件风险相关(优势比[OR] = 0.26;95%可信区间:0.086-0.77)。

同样，根据校正潜在混杂因素(年龄、吸烟、临床分期、切除类型和手术方式)后的多变量logistic分析，结果显示，手术时间、术中出血量、术后住院时间和术后住院时间是影响患者预后的独立危险因素。

TDLNs+的发生与原发瘤床pCR/ MPR-P事件的风险显著降低相关(OR = 0.27;95%CI: 0.09 ~ 0.79)。

值得注意的是，入侵的TDLNs数量越多，非pCR/MPR-P的频率越高。

总之，这些结果表明，在肺癌原发瘤床中，TDLNs+的存在似乎对ICIs的反应产生负面影响，这与上述代谢反应数据一致。

值得注意的是，22.7%(5 / 22)的病例具有pCR-P，这表明与配对的原发肿瘤相比，TDLNs+中的肿瘤细胞对相同的ICIs治疗具有不同的治疗反应，这强化了上述观点，即原发瘤床表现出与配对的TDLNs不同的反应模式。这些结果提示TDLNs阳性的转移性肿瘤可能代表了一个特殊的群体，能够逃避免疫监视，对ICIs治疗产生耐药，从而导致ICIs治疗失败和肿瘤复发。

新辅助ICIs治疗后出现TDLNs+预示术后预后不良：

接下来试图探索新辅助ICIs治疗后TDLNs状态与这些患者术后预后之间的关系。

本研究中，1例术后29天死于胸腔胸膜瘘，并被排除在后续的生存分析中。

中位随访时间为806天(范围133-1399天)。截至随访结束，23.9%(16 / 67)的患者肿瘤复发，17.9%(12 / 67)的患者死亡，其中3例为MPR-P型，2例为pCR-P型。

3年无复发生存率和总生存率分别为70.0%和79.0%。

总体而言，新辅助ICIs治疗后TDLN+患者的RFS明显短于TDLN-患者。

此外，在校正协变量(年龄、吸烟、临床分期、切除类型、原发肿瘤床的反应和切除TDLN站的数量)后，多变量Cox分析确定TDLNs- 与治疗后更长的RFS显著相关(危险比[HR]= 0.20；95%可信区间:0.051-0.76)。

在TDLN-病例中有OS延长的趋势，尽管差异没有达到统计学显著性，这可能是由于样本量小，随访持续时间短。因此，需要进一步的研究来调查TDLNs+对接受新辅助ICIs的患者的长期预后的影响。

更重要的是，即使在pCR-P的情况下，我们也观察到TDLNs+的存在是RFS和OS的不利因素，表明其预测作用与原发性肿瘤床对ICIs治疗的反应程度无关。

这些观察表明，新辅助ICIs治疗后TDLNs+内的残留肿瘤细胞是肿瘤复发的潜在关键来源。

此外，高PD-L1 TPS评分也与较好的预后相关。

TDLNs+的转移定植与T细胞排斥相关：

TDLNs富集了多种免疫成分，其中大部分是T和B细胞。TDLN间质内的成分，如HEV、FRC和滤泡树突状细胞，也被证明在协助抗肿瘤免疫功能方面发挥关键作用。

ICIS可以重新激活耗尽的免疫细胞，并且可以增强来自外周循环的免疫细胞的募集。然而，很少有研究描述新辅助ICIS治疗后TDLNS-和TDLNS+之间的免疫和非免疫亚群。

T细胞(CD8和PD1共染色)的特征表明，尽管接受了新辅助ICIS治疗，CD8+T细胞主要分布在TDLNS+转移灶周围，但很少渗透到转移灶中。而其邻近完整的LN区(无肿瘤受累)的CD8+T细胞密度远高于配对TDLN内的密度。TDLN+内的CD8+T细胞总数(每个组织切片)远低于其配对的TDLN-。

这些观察表明，T细胞在TDLNS+内的转移灶中的渗透受到极大的限制。值得注意的是，在ICIs治疗后的TDLNs+中，只有一小部分(平均：4.9%)瘤周CD8+T细胞共表达PD-1，而TDLNs+内相邻LN区域中PD-1+T细胞的数量与配对TDLN-内的数量相当。这表明由于CD8+T细胞的耗尽而无法渗透到转移灶的可能性较小。

类似地，我们观察到CD4+T细胞也主要分布在周围，很少穿透到TDLNs+内的转移灶中。

在邻近完整的LN区域(无肿瘤受累)中，CD4+T细胞的密度没有差异，而TDLNS+内的CD4+T细胞总数(每个组织切片)远低于其配对的TDLN-。

重要的是，与配对的TDLN-相比，TDLNS+在瘤周完整的LN区域有更多的FOXP3+CD4+T细胞，这与先前证明免疫抑制的FOXP3+Treg细胞在TDLN内聚集的证据是一致的。

此外，TDLNs-中CD19+ B细胞更为丰富。

TDLN+与HEVs异常、FDCs和cDCs减少相关：

淋巴细胞进入肿瘤的转运对于抗肿瘤免疫和ICIs的疗效至关重要。高内皮小静脉(High endothelial venules, HEVs)是免疫细胞运输/迁移的途径，并且被认为可增加预充T细胞浸润，从而增强抗肿瘤T细胞免疫。

TDLNs内HEVs的特征表明，转移灶周围的HEVs形态高度压缩和塌陷。与匹配的TDLN-相比，其直径要小得多。此外，TDLNS+内的HEVs密度显著降低。

这些数据表明，TDLNS+内的转移灶可能导致HEVs的畸形/功能障碍，从而导致启动的淋巴细胞进入原发肺肿瘤床的能力受损，这可能与上述TDLNS+病例的原发肿瘤床的病理反应差有关。

滤泡树突状细胞(FDCs)是TDLNs基质细胞的另一个关键亚群，通常位于淋巴结的B细胞滤泡和生发中心。FDCs是一种向B细胞提呈抗原的B细胞，与传统的树突状细胞(CDCs)在谱系和功能上有本质区别。在新辅助免疫治疗后，我们发现TDLN阳性患者的邻近完整的淋巴结区域与TDLN阴性患者相比，FDCs和cDCs显著减少。

综上所述，这些数据表明，TDLNs阳性的转移灶可能重塑了间质，这可能是TDLNs介导的抗肿瘤免疫动员受损的部分原因。

Discussion

TDLNs是抗肿瘤免疫的关键器官，在介导ICIs治疗效果中起关键作用。

虽然多种因素与ICIs耐药相关，但很少有研究探讨在临床中经常观察到的TDLNs转移与肺癌ici治疗耐药/失败之间的关系。

此外，目前还缺乏在ICIs治疗中比较TDLNs+和TDLNs-患者免疫特征的研究。

更重要的是，这一过程所涉及的机制尚不清楚。

我们的研究揭示了TDLNs在抑制其配对的原发性肺肿瘤治疗反应方面的未被充分认识的作用，以及TDLNs+和TDLNs-之间的差异细胞组成，这进一步促进了我们对TDLNs作为有效ICIs治疗肺癌的重要组成部分的理解。

TDLNs在肿瘤免疫和对ICIs反应中的作用：

虽然最近的证据强调了TDLNs在确定ICIs疗效方面的关键作用，但这些证据主要是基于其他类型癌症的临床前小鼠模型。

在临床肺癌患者中，TDLNs状态与ICIs治疗反应之间的关系尚不清楚。

新辅助ICIs治疗后的手术提供了一个理想的环境和一个独特的机会来回答这个问题，因为原发肿瘤和区域TDLNs可以同时切除和研究在我们的研究队列中，我们发现22例pCR-P的病例中有4例在匹配的TDLNs中有病理证实的转移病灶，特别是在N2淋巴结，这与新辅助免疫治疗加手术后较差的生存率相关。

这些结果表明，残留的肿瘤细胞不仅可以逃避免疫监视而迁移到TDLNs，而且对ICIs产生耐药。这定义了一种特殊的情况，即抗肿瘤免疫功能失调，不能激发有效的抗肿瘤免疫。

TDLNs微生态系统中的免疫细胞和非免疫细胞可能参与其中。

记忆或祖细胞CD8+ T细胞是介导抗肿瘤免疫的关键肿瘤特异性淋巴细胞。

此外，最近越来越多的人注意到HEVs，它们是允许淋巴细胞通过TDLNs再循环的特化血管，并且对于有效的ICIs治疗是必不可少的。

在本研究中，我们发现，与TDLNs-相比，TDLNs+内的HEVs数量和表达(MFI)显著降低。

此外，TDLNs内的HEVs是畸形的。与此一致，最近的证据表明，固体压力可重塑TDLNs+中的HEVs，导致转移灶内的淋巴细胞被排除。

此外，其他免疫细胞，如B细胞，传统树突状细胞和非免疫细胞，如FRCs，也在促进免疫反应中发挥作用，在TDLNs+中下降。

PET-CT在预测ICIs病理反应中的应用：

PET-CT已被常规用于临床恶性诊断和TDLNs转移的检测，以及评价治疗效果。

在肺癌中，原发肿瘤床对ICIs的治疗反应的组织病理学检查和影像学评价的一致性较差已被广泛报道。

然而，我们发现，在新辅助ICIs的背景下，PET-CT在评估原发肿瘤床的肿瘤疗效方面提供了一定的价值，而对TDLNs则无此作用。

在这个队列中，我们观察到新辅助ICIS后异常TDLN的增大，特别是在有MPR/pCR-P的病例中。

这些观察提出了一个基于PET-CT的TDLN病理反应评估的重要问题，TDLNs也被纳入基于广泛使用的RECIST V1.1指南的治疗反应评估。

我们的观察得到了其他几项研究的支持。关于代谢活性，与原发肿瘤床相比，我们观察到新辅助ICIS后SUVmax值有增加的趋势，这与匹配的原发肿瘤床中的病理反应程度无关。

值得注意的是，这一现象被证明是ICIs所特有的，而不是化疗。

因此，至关重要的是确定有效的策略，在手术前准确确定TDLN的病理反应，特别是那些患有pCR-P的患者，因为ICIs后可以避免手术。

18F-FDG PET-CT主要通过测量葡萄糖摄取来反映肿瘤的代谢活动，因为肿瘤细胞被认为消耗比正常细胞高得多的葡萄糖来支持其无限生长。

为什么ICIS治疗后无肿瘤的TDLN的SUVmax值增加还未被研究过。

令人惊讶的是，最近的一项研究表明，髓系细胞摄取肿瘤内葡萄糖的能力最强，其次是T细胞和癌细胞。

相反，癌细胞主要摄取谷氨酰胺和脂肪。

这些发现可能解释了ICIs治疗后TDLNs对葡萄糖的摄取增加，从而导致高度炎症反应。

因此，谷氨酰胺而不是基于葡萄糖的PET-CT成像可能有助于ICIs的治疗反应。

新辅助ICIS术后系统性切除与选择性切除TDLNs的比较：

在根治性手术中，TDLNs被常规和系统切除，以提供准确的分期，确认完全切除，预测预后，并决定是否需要术后辅助治疗。

因此，在非小细胞肺癌的临床实践中，建议至少切除6个淋巴结，其中3个来自N2区(纵隔，特别是隆突下淋巴结)，3个来自N1区这个标准的手术程序已经建立了很多年。

有趣的是，近期在黑素瘤和乳腺癌患者的临床证据并不支持常规使用局部LNs的完全切除，因为完全切除不能改善这些患者的预后。

因此，考虑到新出现的证据强调TDLNs是产生有效肿瘤特异性T细胞应答的最关键部位，不加区别地切除所有TDLNs是否会损害后续ICIs的益处，值得重新考虑。

最近，一项涵盖了5117名临床I-III期非小细胞肺癌患者的回顾性研究表明，不严格的TDLNs切除与显著改善的5年RFS和OS有关。

这些发现再次唤起我们对非选择性TDLNs切除的必要性的思考，特别是在免疫治疗的背景下。

值得注意的是，来自其他研究已经在临床前模型中表明，TDLNs在基于PD-1/PD-L1的免疫治疗中发挥关键作用，并且在免疫治疗前手术切除TDLN会阻碍治疗结果。

一致的是最近的证据表明，需要在肿瘤微环境之外募集新启动的效应T细胞，以确保ICIs的疗效。

上述研究引起了人们对如何对接受新辅助ICIS治疗的非小细胞肺癌患者进行TDLN手术切除的关注。

在本研究中观察到，在一些在原发肿瘤床进行聚合酶链式反应的病例中，TDLN中仍有残留的肿瘤细胞。

因此，一种最佳的方法是选择性地切除残留肿瘤的TDLN，但保留完整的无肿瘤TDLN，以便为后续的辅助ICI治疗保留区域免疫。

这种手术策略的前提条件是需要一个可靠的指标，在术前或术中明确定位转移性TDLN。

Conclusion

总体而言，TDLNS+代表了一种特殊的情况，在这种情况下，抗肿瘤免疫被显著抑制。

长期以来，TDLN的作用一直被忽视，针对异常TDLN的治疗靶向可能会促进抗肿瘤T细胞的充分激活及其随后的肿瘤侵袭，以确保ICIs治疗的有效。

全面了解TDLN中肿瘤迁移和生长的机制是克服对ICIs的耐药性和开发有效的治疗方法根除TDLN转移的关键，这需要进一步的研究。

本研究的主要局限性包括样本量小，以及新辅助ICIS治疗的患者是由一个多学科团队挑选的。此外，因为PD-L1的表达和LUSC中一些频繁突变基因的存在，如Keap1/NFE2L2，也与ICIS的反应有关，而本研究没有所有病例的PD-L1表达数据和原发肿瘤和/或配对TDLN的遗传信息。

另一个潜在的问题是，由于样本量非常有限，本研究没有单独分析不同反应程度的成对原发肿瘤床之间TDLN免疫细胞图谱的差异。此外，最好利用更多的标记物来更准确地定义TDLN内免疫细胞的类型。

此外，在新辅助ICI治疗前，所有样本的TDLNs状态均未得到病理学证实，这可能会影响临床分期的准确判断以及后续分析TDLNs状态与ICI治疗反应的关系，因此需要进行前瞻性临床研究。