PCR引物设计软件primer5

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Primer Premier 5 是一款分子生物学试验常用的PCR引物设计软件，下面简要介绍一下该软件的使用方法。

第一步：打开primer5软件（图1）.

 图1

第二步：依次点击File –> New –> DNA Sequence（如果用蛋白序列做模板，则选择Protein Sequence）（图2），弹出工作窗口（图3）。

图2

图3

第三步：将模板序列粘贴（Ctrl+V）到工作窗口的空白区域，此时会弹出Paste选项对话框，默认选择As is，点击OK即可（图4）。

图4

第四步：依次点击Primer（图5） –> Search（图6），弹出引物设计参数对话框（图7）。

图5

图6

第五步： 在引物设计参数对话框（图7）中，需要手动设置引物搜索范围（Search Ranges），该demo序列中301-1649bp为目标序列，1-300bp和1650-1950bp为侧翼序列，作为上下游引物的搜索范围。PCR Product Size最大值一般设为序列总长度即可。Primer Length一般不做调整（20bp±2bp）。最后点击OK即可。（图7）

图7 

 第六步：待搜索完成，点击OK。（图8）

 第七步：Search Results对话框中列出了符合要求的引物信息，如图9，点击第一个引物对信息后，在左侧Primer Premier对话框中显示出该引物对的详细信息；可根据Tm值、Hairpin、Dimer、False Priming、Cross Dimer等信息进行取舍，一般选取分值最高的引物对即可。

图9

 第八步：点击Edit –> Copy 然后分别选择Sense Primer和Anti-sense Primer，将引物粘贴到word或excel中，用以引物合成。

　　5′  TGGACTCATCGCCTCCTA  3′

　　5′  CGCTTCACATCCCTCACA  3′