宝藏！转基因株系检测的N种方法

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伯小远经常收到同学咨询如何检测过表达/突变体株系的问题，今天小远就再来分享一下吧。

检测过表达株系

PCR检测真核抗性基因or目的基因

对聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR），咱就不多说了，每个进入分子实验室的同学最先接触的实验除了提质粒，那就是PCR啦。

检测过表达株系，可以检测两类基因：（1）真核抗性基因，常见的是潮霉素磷酸转移酶基因（HptII）、草丁膦乙酰转移酶基因（Bar）、新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）等，这些基因序列固定，每个实验室估计都有固定的、“传承”下来的引物序列；（2）目的基因，在T-DNA上设计一条引物，在目的基因上设计另一条引物，用这两条引物来进行PCR扩增。

图1 PCR体系。PCR反应体系由DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR反应缓冲液组成。PCR反应在PCR仪中通过控制反应体系的温度来实现。

图2 PCR的扩增过程。PCR包含下列三步反应：变性（denaturation）、退火（annealing）、延伸（elongation），此三步反应为一个循环，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。

举例

图3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 (Zhou et al., 2016)。除了7、12、94号株系外，所有的转基因株系都扩增出了Bar基因140bp的条带。

荧光定量PCR检测mRNA的相对表达量

PCR扩增是一种指数扩增，理想状态下，当把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值（即荧光阈值），那么循环数与起始浓度的对数就是线性关系，这就是荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）相对定量的基本原理。

检测过表达株系，可以先提取目标株系的总RNA，然后将RNA逆转录成cDNA，通过qRT-PCR实验检测靶标的相对表达量。当然，一个内参基因和一个对照样本也是实验中必要的。再利用∆∆Ct法即2-([Ct（样品基因)-Ct(样品内参基因)]–[Ct（对照目的基因)-Ct(对照内参基因)])计算过表达株系目的基因的转录水平变化。有的实验室可以用软件直接生成相对表达量的柱状图，有的实验室也有固定的、“传承”下来的Excel表格可用来计算数据，再根据数据做图。

当然，大家也别忘记，qRT-PCR技术也可用于绝对定量检测、拷贝数鉴定、基因型鉴定等实验。

图4 两种不同原理的荧光定量PCR扩增过程。（左）Taqman探针法：使用含有荧光基团的Taqman探针，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，但在进行延伸反应时，聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，即每扩增一条链，就有一个荧光分子形成，因此荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。该方法可以在同一反应中进行多靶点的检测。（右）SYBR Green I法：使用染料分子SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。

举例

图5 qRT-PCR检测ScCHS2、ScF3H1、ScDFR3、ScANS、ScAG、ScAGL11和ScbHLH17基因的在五个时期的相对表达量 (Qi et al., 2022)。

Western blot检测目的蛋白

蛋白质免疫印迹实验（Western blot）是将细胞或组织中的蛋白质通过电泳分离，从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某种抗原（目的蛋白）的一种检测实验。使用特异性抗体对样品进行着色，通过分析着色的位置和深浅获得目的蛋白在细胞或组织中表达情况的信息。

Western blot中有两种一抗可以使用：（1）目的蛋白的特异性抗体，一般需要委托公司来生产，成本昂贵。（2）针对特定标签的标签抗体，商业化程度高、特异性强。使用这种抗体时，别忘记在构建转基因载体时，在目的蛋白的N端或C端加上标签，常见的例如His，Flag，Myc等。标签蛋白与目的蛋白就融合在一起，通过检测标签蛋白就可以来表征目的蛋白的表达情况。

图6 Western blot的实验过程。实验流程大致分为：提蛋白，蛋白含量测定，制胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白样品，转膜，封闭，孵育一抗，漂洗，孵育二抗，漂洗，加入化学发光底物，胶片曝光，得到结果图。

举例

图7 FIE蛋白的表达量随春化时间的延长而变化 (Wood et al., 2006)。拟南芥在16h光照/8h黑暗的正常条件下培养12d后转移至4℃培养，在培养的第0、1、8、16、32d取样检测FIE蛋白的表达情况（1-5泳道），在结束32d春化后移回正常培养条件2d后取样检测FIE蛋白的表达情况（第6泳道）。

免疫层析试纸条检测真核抗性蛋白

免疫层析试纸条是一种快速免疫分析技术，是目前常见的检测方法之一，具有操作简单、检测快速、结果易观察、样品需要量少、成本低、携带和保存方便等优点，适合现场检测及大规模筛查检测。

常见的免疫层析试纸条是基于对转基因株系中外源蛋白的检测，如Cry1Ac、Cry2A、BAR、PAT、CP4-EPSPS等蛋白。只需将植物的叶片或种子经过简单的破碎处理，就可进行检测，5-15min即可得到结果。

图8 免疫层析试纸条结构 (夏启玉等, 2017)。试纸条由样品垫、结合垫、反应膜、检测线（T线）、质控线（C线）、吸收垫及背衬组成。免疫层析试纸条可分为两类，夹心法和竞争法。以胶体金夹心法为例，简单介绍一下原理：将金标抗体（Au）Ab1吸附在结合垫上，捕获抗体Ab2喷涂于T线，抗Ab1二抗喷涂于C线。待测样品通过毛细管作用向前层析，层析至结合垫上时溶解其上的金标抗体，如果样品中含有待检抗原（Ag）则会与（Au） Ab1结合，形成（Au） Ab1-Ag继续向前层析，前行到T线时被抗体Ab2捕获形成（Au） Ab1-Ag-Ab2的复合物，T线显现红色条带，过量的（Au） Ab1继续前行，在C线处被抗Ab1二抗捕获形成复合物，C线也显示红色条带，为阳性结果；若T线无条带，C线为红色条带，为阴性结果。

举例

图9 免疫层析试纸条检测Bar蛋白。图片来源：伯远生物转化部大豆组。鉴定结果显示全部为阳性苗噢！

TAIL PCR鉴定T-DNA插入位点

T-DNA插入位点的获得对于植物功能基因组学研究及转基因植物的筛选鉴定十分重要。检测T-DNA在基因组上的插入位点，通常使用热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，简称TAIL-PCR），TAIL-PCR是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术 (Liu et al.,1995, Tatjana Singer et al.,2003)。

TAIL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（简称sp1、sp2和sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的（14bp）随机简并引物（简称AD）相组合，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的PCR反应叫做“半特异性PCR”。这种反应会产生3种不同类型的产物：（1）由特异性引物和简并引物扩增出的产物；（2）由同一特异性引物扩增出的产物；（3）由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中，后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。

图10 TAIL-PCR的扩增原理。图片来源：伯远生物官网。

基于二代测序技术鉴定T-DNA插入位点

TAIL-PCR除了存在操作复杂、耗费时间等缺点外，也存在特异性较差、效率低等问题。基于二代测序技术鉴定T-DNA插入位点的方法也逐渐被许多研究者使用。

首先将基因组用超声波片段化，末端修复加A后，连接一个带有barcode的接头序列，barcode用于区分不同的样品，接头序列为Illumina测序平台通用测序接头P5和P7，然后根据插入片段和接头序列，分别设计特异性引物扩增片段，再进行二代测序。当然，也可以不进行特异性扩增及纯化而直接进行测序，也就是单纯的全基因组重测序（图12），这种方法也是可以的，只是测序量较大、成本较高。

图11 基于二代测序技术鉴定T-DNA插入位点的实验原理。图片来源：伯远生物官网。

举例

图12 基于二代测序技术获得的T-DNA插入位点检测结果 (Lv et al., 2021)。对三个阳性植株（#2、#3、#7）进行基因组测序，对基因组进行25-31倍的覆盖测序，得到1.3亿条clean reads，再和参考基因组、T-DNA序列进行比对分析。

Southern blot鉴定拷贝数

在转化过程中，外源T-DNA随机插入植物基因组，插入的位点和拷贝数都不固定。插入的拷贝数较少则能较好的表达外源基因，插入的拷贝数多则可能会导致外源基因表达不稳定甚至沉默。因此，检测T0代植株外源基因的拷贝数是研究其分子机制的基础实验之一。

Southern blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。其原理是将待测的DNA样品用限制性内切酶消化，并通过琼脂糖凝胶电泳分离，再固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出插入的拷贝数。

图13 Southern blot的实验过程。图片来源：LibreTexts。

举例

图14 Southern blot检测T0植株中T-DNA的拷贝数，使用HPT基因的部分序列作为探针 (Wu et al., 2015)。

荧光定量PCR鉴定拷贝数

Southern blot鉴定拷贝数的优点是准确性高、特异性强，是鉴定拷贝数的金标准，缺点是成本较高、操作复杂，而且受到酶切位点的限制，另一种基于qRT-PCR绝对定量技术鉴定拷贝数的文献近些年逐渐增多。

qRT-PCR鉴定拷贝数，一般使用绝对定量的方法，通常的做法是提取目标植株的总DNA，扩增出靶标基因，然后将该基因克隆到载体上，提取高纯度重组载体进行拷贝数定量，绘制靶标基因的标准曲线。然后再选择一个拷贝数已知的内参基因（内参基因一般选择拷贝数少，同一物种内的不同品种间具有稳定的序列结构和拷贝数的一类基因），绘制拷贝数定量曲线。分别测定样本中靶标基因和参照基因的拷贝数，靶标基因与参照基因检测值的倍比×参照基因的拷贝数即得到靶标基因拷贝数。

表1 使用∆∆Ct法计算拷贝数 (Bubner et al., 2004)。

如何鉴定植株是否纯合

对于过表达的株系，一般没必要等植株纯合再进行后续分子实验，因为过表达其实就相当于在基因组中插入了一个显性基因，杂合子是绝对可以进行后续实验的。如果实在是有必要鉴定转基因植株是否纯合，目前有两种方法：（1）让T0代自交，得到T1代，根据孟德尔遗传定律，按照性状3:1分离，舍弃1份的阴性植株，再让剩下的3份T1代继续自交，得到T2植株，按照子代性状无分离和性状3:1分离来推测出T1代的纯合株系和杂合株系。（2）结合T0和T1植株的拷贝数来分析，例如当T0代为1个拷贝而T1代为2个拷贝时，则该T1植株为纯合株系（表2）。

举例

表2 分析T0和T1植株的拷贝数，粗体数字表示由相应的T0、T1植株中的拷贝数鉴定得到的纯合植株 （Głowacka et al., 2016）。

检测基因编辑株系

PCR检测基因组靶点

使用CRISPR/Cas系统编辑植株会导致植物基因组被编辑，编辑形式为插入、删除、替换，因此在检测基因编辑株系时，在被编辑的靶位点两侧设计合适的引物，对靶位点及附近的序列进行PCR扩增，再进行一代测序，并把测序结果上传至DSDcode网站进行解析 (Liu et al., 2015)，网站会根据测序的信号双峰嵌套位置和强弱判断突变类型，但当位点存在两种以上的突变类型时，该网站无法进行区分。此时，可将PCR产物进行克隆、测序，可以确切判断具体的突变类型。

图15 在基因组靶位点附近1000bp范围内设计引物进行扩增、检测，最好控制在500-700bp范围内。图片来源：伯远生物官网。

植物细胞中有两种途径可以修复DNA双链断裂（DSBs）：同源重组（Homologous recombination，HR）和非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）。HR在植物中的修复效率非常低，NHEJ在DNA双链断裂处容易产生少数碱基的插入或缺失，导致基因失活，这也是目前CRISPR/Cas基因编辑系统的主要修复途径。

对于二倍体植物来说，NHEJ修复之后会产生5种突变类型：

（1）没有产生任何突变；

（2）单等位基因突变，只有一个等位基因发生突变，也称杂合突变；

（3）双等位基因杂合突变，两个等位基因都发生突变，但是突变的类型不一样，该突变形式常导致软件无法区分，需要继续做克隆及测序来进行鉴定；

（4）双等位基因纯合突变，两个等位基因发生相同的突变，这是研究者们最想要的突变类型；

（5）嵌合体，同一个植株上有3种或3种以上的突变类型。

多倍体产生的基因编辑类型同上。

对于基因编辑靶点检测，难度最大的是对多倍体的检测或者多个同源基因的检测，我们公司的经验是先下载同源序列，再根据同源序列设计可区分不同位置上的靶点的引物，在扩增基因编辑苗之前可用野生型株系的基因组作为模板提前将引物筛选一下，再用筛出的比较合适的引物来扩增编辑苗。举个例子，油菜是异源四倍体，不管是在设计靶点还是设计检测引物时，都要考虑其四倍体的特性（图17）。

举例

图16 番茄nor-like基因的两个突变株系的编辑情况 (Gao et al., 2018)。（a）nor-like基因的结构及四个靶点的示意图；（b）nor-like基因的两个突变株系#1、#11的编辑情况，这两个突变株系均为双等位纯合突变，#1有1个碱基的插入，#11有11个碱基的删除，红色序列表示靶位点，绿色序列表示被编辑的情况，蓝色序列表示PAM序列。

图17 对油菜BnSFAR4基因的靶点设计及突变株系的靶点检测结果 (Karunarathna et al., 2020)。（a）在BnSFAR4基因的外显子II中选择了一个20bp的区域作为靶点；（b）对基因编辑株系的四个BnSFAR4基因的靶点进行检测后的结果示意。红色序列为突变后序列。

基于二代测序技术的高通量基因编辑检测

上述使用一代测序的方法（Sanger测序）鉴定突变体材料效率较低，无法大规模的对突变材料进行鉴定分析，基于二代测序技术的高通量基因编辑检测方法不仅大幅提高了测序通量，同时也降低了测序成本，当然，还有一个显著的优点是，可以精准的获得每个样品的突变类型和序列，不会出现一代测序检测方法中常出现的不确定突变形式的问题。后者基于多重PCR建库技术，对靶标进行两轮PCR来达到建库和富集的目的 (Liu et al., 2019)（图18）。

图18 基于二代测序技术的高通量基因编辑检测流程图。基本的实验步骤如下：（1）针对靶位点区间设计特异性引物，可以在上下游特异性引物带上barcode序列，方便多样品混合；（2）利用步骤1针对靶位点设计特异性引物，对目的片段进行首轮PCR，获得目的片段；（3）以步骤2中扩增获得片段为基础，进行第二轮PCR扩增，加上测序接头；（4）混样后，即可进行二代测序；（5）对测序结果进行比对、分析。

举例

表3 基于二代测序技术的高通量基因编辑检测的结果展示。表格来源：伯远生物检测部。我司提供给客户的表格包含株系号、基因号、靶标序列、Reads数、突变类型、突变后的序列等信息。

注：M: 完全匹配；D：碱基缺失；I：碱基插入。

检测基因编辑突变体库

在植物中，目前已有许多使用CRISPR/Cas技术创建突变体库的报道。同时，我司在利用CRISPR技术创建大规模突变体库方面拥有丰富的经验，多次为合作伙伴提供大型突变体库项目的整体解决方案，在设计靶标、构建基因编辑载体库、采用何种方式进行遗传转化以及对突变体植株的后期管理已形成完善的全周期管理系统。可参考文章“秋天的第一篇推送——突变体库，如何创建”。

对于突变体库的检测，大致可分为以下检测过程：（1）经过遗传转化出苗后PCR进行阳性鉴定；（2）确认每株苗中的sgRNA，二代测序检测；（3）确认突变类型，扩增靶标，二代测序检测。

对于（1）和（3），咱都比较熟悉了，所以只讲一下（2），因为创建突变体库一般采用的是混转策略，将含有不同基因编辑载体（即含有不同sgRNA的载体）的农杆菌混在一起，再对外植体进行侵染、共培、分化出苗等步骤，所以在这个过程中，阳性植株中的sgRNA具体是哪一个我们是不清楚的，并且还可能会同时插入多个sgRNA，因此，我们需要根据插入的sgRNA的情况来确定需要检测的靶标。

对于转化阳性率很高的物种，可以把（1）省略，直接进行（2）和（3）即可，因为未检测到sgRNA，则可认为是阴性苗，直接舍弃即可。

举例

表4 鉴定突变体库的sgRNA（部分展示）。表格来源：伯远生物检测部。

T-DNA插入突变体检测

在基因编辑突变体库出现之前，很多植物已经有突变体库，这些突变体库中有一些是T-DNA插入突变体，即T-DNA插入到植物的基因组中，引起基因失活，即产生了功能缺失性突变，比较出名的例如拟南芥SALK突变体库，其材料背景为Columbia-0，使用的转化载体为pBIN-pROK2，真核抗性为Kan，检测购买的SALK突变体是否纯合，可参考文章“快收好，拟南芥突变体鉴定方法”。

一些其他的检测方法

数字PCR是近年来发展起来的一种精确的核酸绝对定量方法，该方法将微量样品进行极度稀释和分液，直到每个细分的待测样品中所含有的待测分子数不超过1个后，再将所有细分的待测样品进行PCR扩增，然后对扩增反应的样品逐一计数，从而判断待测样品的最初浓度。其优势在于不需要依赖Ct值和标准曲线，就能够实现对起始样品的绝对定量。

等温扩增技术也是近年发展起来的一种快速核酸检测技术，因其扩增过程不需要特殊仪器、不需要温度循环，即可实现扩增。其中环介导等温扩增技术（LAMP）已经得到较多的应用，通过设计的引物能特异性地识别靶标序列的6个区域，在链置换性聚合酶（Bst酶）作用下，在恒温（60-65℃）条件下，大约40-60min即可完成核酸扩增 (张晓磊等, 2020)。

当然，还有其他很多检测方法，篇幅所限，伯小远就不再多写啦。

小远叨叨

过表达/突变体株系检测粗略可分为两大类，一类是基于核酸序列的方法，如定性PCR、荧光定量PCR、数字PCR、等温扩增等；另一类则是基于免疫学的方法，如ELISA、Western、试纸条等。随着政策的利好、技术的发展，灵敏、快速、高通量、自动化的转基因检测方法成为了发展趋势。这需要我们不断的创新与进步，愿更多有志之士参与到生命科学的产业化进程中来！

References：

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Głowacka K, Kromdijk J, Leonelli L, Niyogi KK, Clemente TE, Long SP. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 2016 Apr;39(4):908-17. doi: 10.1111/pce.12693. Epub 2016 Jan 21. PMID: 26670088; PMCID: PMC5021166.

Karunarathna NL, Wang H, Harloff HJ, Jiang L, Jung C. Elevating seed oil content in a polyploid crop by induced mutations in SEED FATTY ACID REDUCER genes. Plant Biotechnol J. 2020;18(11):2251-2266. doi:10.1111/pbi.13381

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Qi F, Liu Y, Luo Y, et al. Functional analysis of the ScAG and ScAGL11 MADS-box transcription factors for anthocyanin biosynthesis and bicolour pattern formation in Senecio cruentus ray florets. Hortic Res. 2022;9:uhac071. Published 2022 Mar 23. doi:10.1093/hr/uhac071

Singer T, Burke E. High-throughput TAIL-PCR as a tool to identify DNA flanking insertions. Methods Mol Biol. 2003;236:241-272. doi:10.1385/1-59259-413-1:241

Wood CC, Robertson M, Tanner G, Peacock WJ, Dennis ES, Helliwell CA (2006) The Arabidopsis thaliana vernalization response requires a polycomb-like protein complex that also includes VERNALIZATION INSENSITIVE 3. Proc Natl Acad Sci U S A 103 (39):14631-14636. doi:10.1073/pnas.0606385103

Wu, Jinxia; Zhang, Zhiguo; Zhang, Qian; Liu, Yayun; Zhu, Butuo; Cao, Jian; et al. (2015): Detection of the T-DNA copy number in T0 FOX lines by Southern blotting using HPT as a probe.. PLOS ONE. Figure. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132314.g003

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转基因植株检测

基因编辑植株检测（基于一代测序）

高通量基因编辑植株检测（基于二代测序）

拟南芥SALK突变体检测

荧光定量PCR检测（相对表达量、拷贝数鉴定、基因分型、特殊RNA检测）

基于二代测序技术鉴定T-DNA插入位

2×Taq PCR Mix、琼脂糖、DNA Marker等