通过建立一种转基因株系的方法，对油菜的生长和产量有何影响？

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文丨雨燕的小世界

编辑丨雨燕的小世界

油菜是一种重要的油籽作物，为全球植物油生产提供了大量的生物质。

建立高效的遗传转化系统，采用便捷的转基因阳性筛选方法，对基因功能分析和分子育种具有重要意义。

然而，据我们所知，上述系统很少可用于油菜。

基于油菜成熟的遗传转化系统，构建了59个携带Discosoma sp.红色荧光蛋白编码基因的载体，并通过农杆菌介导的下胚轴转化整合到油菜籽中。

在组织培养基中，通过肉眼筛选方法平均有1.96%的组织被红色荧光标记，其中1.90%的组织平均被7个不同油菜品种的客观基因扩增。

此外，通过整合DsRed对幼苗进行目视筛查，包括种子萌发期间的种皮、根、下胚轴和子叶。

开发了一种快速、方便、高效的转基因植株获取方法，有助于获得最大比例的转基因阳性再生幼苗，从而避免了长时间的植株再生，这项研究的结果将有利于基因功能研究，特别是在高通量分子生物学研究中。

芸苔油菜是一种重要的油籽作物，是全球油籽生产第二重要的作物，它来源于B. rapa和B. oleracea之间的杂交。

为了满足对石油日益增长的需求，必须通过基因工程技术改善各种重要的经济和农业性状，这是基因功能分析和作物改良的有力工具。

遗传转化技术通过整合新基因来满足高产优质作物的需求，包括有效产油、除草剂和抗病特性，促进了作物品种的改良。

它已被成功地用于改良一些主要作物，如大豆，玉米和棉花，通过转基因方法改良的上述植物的新品种现在在许多国家广泛种植，为农民带来了巨大的好处。

然而，据我们所知，与其他作物相比，油菜籽的遗传转化技术在转化效率上仍然相对较低，在阳性筛选方面效率较低。

因此，一个合适和有利的遗传转化系统伴随着高效的筛选方法对于油菜籽育种和改良至关重要。

迄今为止，已经报道了几种遗传转化方法，并常规应用于模式植物和主要作物，如拟南芥、本氏烟草、水稻、小麦和玉米。

在油菜中，各种技术，包括PEG介导的DNA摄取、电穿孔、粒子轰击，农杆菌介导的转化和微孢子转染，已被用于获得转基因植物。

在这些技术中，农杆菌介导的转化是最通用、最可靠和最有效的方法。

Maheshwari等人研究了四种不同油菜籽系中激素组合，供体植物年龄和外植株类型对植物转基因频率和再生能力的影响。

他们发现，Invigor 54和Westar品种的转化频率分别为2.53%和7.5020%，但Topas和16系的转化频率分别为0.13%和4.4079%。然而，由于品种内不同的遗传背景引起的遗传转化能力多样化，在一些无法进行基因转化的品种中，特别是在商业品种中，顽固性继续存在。

获得高效的转基因阳性再生幼苗主要取决于后续选择。

然而，植物再生是一个耗时的过程，需要很长的生长周期;同时，它通常还会导致不想要的堕胎和生育能力下降。

许多方法经常用于转基因阳性植物筛选，例如抗生素，PCR，南方印迹分析，GFP或GUS染色。

然而，这些方法很乏味，它们通常使用再生小苗的叶子、根或长方形进行。

因此，有必要开发一种方便高效的筛选方法，以简化和促进植物转化过程。最近，来自Discosoma sp.的红色荧光蛋白，类似于二级结构中的维多利亚绿荧光蛋白，已被应用于通过植物中的视觉筛选来鉴定转基因种子。

DsRed的激发波长和发射波长都比GFP长，这使得转基因阳性筛选更加灵敏。

虽然DsRed和GFP都不影响植物的营养和生殖生长，但GFP更容易受到植物内在叶绿素的影响。

Stuitje等人发现DsRed在拟南芥中的敏感性高于GFP，因此，DsRed已被广泛用于标记叶绿体的转基因花粉、叶片或种子，甚至外增生膜，以进行视觉选择或后代分离。

Eckert等人率先在钩端藻属和眼科菌属中实现DsRed和另一种常见报告蛋白-GFP的表达，以观察真菌病原体物种与油菜籽在体外和植物中的相互作用。

Zheng等人研究了DsRed标记的长孢黄霉菌在温室条件下油菜种子传播的潜力，并证实了病原体从根部到种子的全身生长。

然而，直到现在，DsRed还没有被广泛应用于组织培养或种子发育过程中。

本研究旨在通过将快速转基因阳性筛选技术与高效的农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化系统相结合，构建一种方便高效的方法来获得油菜转基因阳性系。

为实现这一目标，在8个油菜品种和5个表达载体中进行了高效的遗传转化。

此外，引入DsRed作为视觉筛选标记，用于在组织培养和种子发育过程中筛选转基因阳性植物。

本研究为今后专注于高效获取高通量转基因阳性品系的研究提供了良好的基础。

使用的异体四倍体油菜籽基因型包括春季品种佳9709、半冬品种佳2016和8个商业冬季品种，包括钟爽11、钟爽821、中优7633、351、B 3和单2016B。

Jia 9709和Jia 8的种子由华中农业大学张春宇教授慷慨提供。钟爽11号、钟双821号、中优7633号种子由中国农业科学院油料作物研究所研制提供。

1. B 3和山6B的种子由陕西省杂交油菜中心李殿荣教授慷慨提供。将这些油菜籽品种在组织培养室的盆栽中培养，所有有根的幼苗在15-2000勒克斯的温室中以2500×16小时光照和8小时黑暗在25°C下生长。

在生长过程中，每周供水三次，在获得T1种子和再生植物后，用手持绿色荧光手电筒区分阳性转基因种子和幼苗并不容易。

与绿色荧光不同，红色荧光可以在激光共聚焦荧光显微镜下观察到，而不受叶绿素的干扰。

为了验证种子萌发初级阶段的筛选可行性，使用共聚焦显微镜进行了实验。

对于每个部分，随机选择种皮，根，下胚轴和子叶进行进一步分析。结果表明，可以在晶种不同部位的所有细胞中成功观察到红色荧光。

此外，通过RT-PCR分析检查种子萌发过程中标记基因DsRed和靶基因BnaA07g17400D在幼苗中的相对表达。

正如预期的那样，外源标记基因DsRed在不同转基因系中表现出显着的上调，并且与WT相比达到了1200倍的水平。

关于推断的内源基因，BnaA07g17400D的相对基因表达在不同RNAi系的转基因幼苗中表现出明显的下调。

此外，在上述RNAi系幼苗的根系、种皮、下胚轴和子叶中，DsRed的相对表达在各器官中表现出相当的上调，特别是在子叶中，这表明在子叶中更容易检测到红色荧光。

简而言之，DsRed作为一种标记基因，在不影响所需RNAi事件的情况下进行阳性筛选是可靠的。

在过去的一个世纪中，农杆菌介导的油菜籽转化已经进行了许多尝试，然而，很少有研究集中在农杆菌的浓度上。

以前，农杆菌感染的浓度是通过调节最终OD600年代这里，不是最终的OD600年代调整但从原始农杆菌溶液中计算体积，以这种方式有效地转化了不同的商品油菜品种、不同的表达载体和不同的基因。

值得注意的是，OD600年代接种的农杆菌仅检测一次，并且可以通过上述方法轻松计算用于进一步实验的移液管体积。

此前，最终的OD600年代在其他研究中，根据原始OD调整为固定值，例如0.05、0.2或1600年代用于外植体感染。

然而，原来的OD600年代在这项调查中，通常在0.4至1.2之间，这是由于原始接种物，细菌浓度和细菌活性的差异。

考虑到外植体对农杆菌的敏感性，发现最终浓度很容易由原始农杆菌溶液的体积控制，而不是为了避免外植体坏死而进行调整。

因此，确保收集的农杆菌的适当细菌活性具有重要意义。此外，应仔细控制潜伏感染的时间和共培养阶段，因为过度附着可直接导致外植体坏死或再生减少。

通常，10分钟用于下胚轴感染，在本研究中在共培养基中维持36-48小时，有时，如果收集的农杆菌或下胚轴状况不佳，感染时间可以适当灵活地延长或缩短1-2分钟。

在共培养基中共培养24小时后，下胚轴应坚韧亮白色，24小时后可转移到CIM，如果下胚轴未显示上述特征，建议应立即或最多12小时后将其转移到CIM以避免外植体坏死。

通过这种方式，在2个油菜品种中实现了高效的转化。此前，据报道将4，46-D添加到共培养基中以促进外源DNA的整合，因为它能够在切口处进行细胞分裂。

此外，AgNO和AgNO都3年代已知可促进原芽的生成和伸长，并增加不定枝分化的频率。

因此，向CIM中添加85 mg/L 8，1-D和2 mg/L AgNO可获得平均4.3%的转基因阳性根幼苗3年代到SIM卡。

不同载体之间的转化效率没有明显差异，因此，使用下胚轴建立有效的农杆菌介导的油菜籽转化系统也将能够对控制重要性状的有价值的基因进行基因组编辑。

基于成熟的转化系统，转化效率高，有效的转基因阳性筛选技术对于缩短油菜组培养周期、简化转化体系具有重要意义。

DsRed作为转基因种子筛选的可选标记基因，有利于分离拟南芥、水稻和亚麻荠等许多植物中的转基因和非转基因种子。

在拟南芥中，DsRed已被用作促进转基因种子筛选的视觉选择标记，然而，考虑到组织厚度的阻碍，DsRed尚未用于油菜籽中，以方便筛选以加速转基因阳性幼苗选择的过程。

DsRed标记愈伤组织和芽发出的红色荧光可以通过红色滤光片使用手持式绿色荧光手电筒轻松观察到。

高达61.2%的愈伤组织用红色荧光观察，几乎所有这些愈伤组织都可以通过PCR分析用DsRed基因检测到。

在荧光体视显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下，也可分别观察到愈伤组织和油菜幼苗的红色荧光。

此外，值得注意的是，荧光强度彼此不同，可能是由于油菜籽基因型，即转基因的同卵或半合性。

此外，DsRed作为南方印迹分析的标记物，也成功地应用于估计转基因后代植物中的41至42个拷贝，这些结果表明，视觉筛选标记DsRed在加速油菜遗传转化系统方面取得了巨大成功。

抗生素筛查经常用于大多数转化研究，如卡那霉素、潮霉素或除草剂，然而，这些物质的剂量可能会影响再生速率，并进一步打破转基因/非转基因种子的平衡。

PCR扩增在植物制备和鉴定中既费时又费钱，南方印迹分析作为鉴定转基因拷贝数的传统方法，在试剂、设备、时间和劳动力方面都非常昂贵。

GUS表达测定是成本方面的折中方案。然而，组织脱色通常需要很长时间，此外，GUS表达测定通常在植物细胞或组织中靶基因表达后进行。

至于GFP，它通常用于用激光共聚焦荧光显微镜确定亚细胞定位，由于其不稳定性，这应该与RFP或YFP有关。

否则，也可以使用荧光显微镜和绿色荧光颜料滤光片使用荧光素二乙酸酯染色的组织进行检测，从而诱导荧光强度降低。

然而，根据我们有限的知识，FDA的测定法几乎没有用于植物。与以往方法相比，本研究首次引入视觉选择性标记基因DsRed加速转基因幼苗筛选。

只有将滤光片与手持式荧光手电筒相结合，即可在油菜籽组织培养和种子萌发的初级阶段轻松区分转基因阳性和转基因阴性植物。

因此，作为标记基因的DsRed的应用将促进转基因阳性系的筛选以及组织培养或细胞培养在植物生物技术中的应用。