邻近标记技术：研究蛋白互作的利器（三）

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邻近标记技术（Proximity Labeling，PL）是一种常常作为研究蛋白互作的技术手段。在邻近标记中，通常会设计一个含有酶活性位点的融合蛋白，比如TurboID或APEX，将此酶与诱饵蛋白融合表达。当这种融合蛋白存在于活细胞内时，如果附近有靶蛋白靠近或结合融合蛋白时，该酶就会催化一种可扩散的小分子标签（如生物素）与靶蛋白以共价键方式结合，从而实现对邻近蛋白质的化学标记（图1）。目前，用于接近标记的酶主要有三种:生物素连接酶(BioID、BioID2、TurboID、miniTurbo)，辣根过氧化物酶(HRP)、抗坏血酸过氧化物酶(APEX、APEX2)。更多邻近标记技术介绍，详见“邻近标记技术：研究蛋白互作的利器（一）”与“邻近标记技术：研究蛋白互作的利器（二）”。标记反应后，再进行细胞裂解，用链亲和素珠富集生物素标记蛋白，并进行质谱分析。

研究蛋白质-蛋白质互作的常规方法是亲和纯化或免疫沉淀，然后用质谱检测(AP-MS/IP-MS)。这种方法是将细胞裂解后，可溶性蛋白被结合在固体载体上的配体(诱饵)，目标蛋白被捕获并富集，再用质谱法分析蛋白质，以确定与相互作用的目标蛋白质。虽然这些方法可以有效地识别在细胞裂解过程中不被破坏的蛋白质-蛋白质的强互作，但在纯化步骤中，需要在高盐和洗涤剂条件下进行，亲和力较低的蛋白间瞬时相互作用可能会丢失。因此蛋白之间的瞬时互作或弱结合是难以被IP-MS所检测到，而PL通过共价键标记的方式能有效检测到瞬时互作或弱结合。在最新研究报道中，邻近标记技术不仅仅可以用在蛋白互作研究上，同时在转录组、蛋白质组空间动态及组蛋白修饰上也有重要的应用。

图1 邻近标记技术原理（Ummethum et al., 2020）

案例一：光催化邻近标记技术揭示转录组空间动态变化

题目：Mapping spatial transcriptome with light-activated proximity-dependent RNA labeling

期刊：Nature Chemical Biology

IF：14.8

发表时间：2019.11

主要方法：

光催化邻近标记测序（Chromophore-assisted proximity labeling and sequencing，CAP-seq）是基于邻近标记技术原理基础上改进的，在蓝光激发下光敏蛋白miniSOG产生的单线态氧迅速对邻近RNA分子上鸟嘌呤的造成氧化损伤，同时将一个带有生物正交官能团的氨基探针共价交联到RNA损伤的碱基上，既而通过富集纯化与高通量测序检测RNA，由于单线态氧扩散距离有限，该反应只在miniSOG附近几十纳米范围内发生，因此具有良好的空间特异性。

实验结果：

将miniSOG靶向于人胚胎293T (HEK293T）细胞的线粒体基质，在蓝光照射下启动反应，20min后终止反应，将细胞固定用于成像分析或裂解提取RNA含量。免疫染色数据显示生物素化信号与miniSOG高度共定位。纯化后的RNA在Cu(I)催化剂存在下与叠氮生物素反应，用链霉亲和素包被的微球富集，并通过RT-qPCR或RNA-seq分析。比较了亲和纯化前后每个基因的FPKM值，结果显示在重复实验中有16个基因富集，包括所有13个mt-mRNA，两个mt-RNA和一个线粒体假基因MTATP6P1。与RT-qPCR结果一致，数据集中没有细胞质RNA得到实质性富集。用同样的方法研究内质网表面的转录组，在内质网膜附近CAP-seq捕获的372个mRNA中，96.2%编码分泌途径蛋白或膜蛋白，这一结果与内质网表面的蛋白质局部翻译模型一致。综上所述，证明了CAP-seq在开放的细胞质空间中也具有高空间分辨率（图2）。

图2 CAP-seq揭示线粒体基质中的亚细胞转录组（Wang et al., 2019）。

案例二：光催化邻近标记技术揭示蛋白质组空间动态变化

题目：Spatiotemporal-resolved protein networks profiling with photoactivation dependent proximity labeling

期刊：Nature Communications

IF：16.6

发表时间：2022.8

主要方法：

将光敏蛋白miniSOG与目标蛋白融合质粒转染进细胞内，并添加外源性含有炔烃手柄的探针，给予蓝光照射后激发光敏蛋白催化产生单线态氧，对周遭蛋白上的氨酸残基进行氧化并促进其与外源性探针的结合，然后进行富集与蛋白质组学分析。

实验结果：

首先用丙炔胺作为化学探针测试了在HEK293T中稳定表达的成熟光敏剂miniSOG蛋白质标记的能力。凝胶内荧光分析显示，在蓝光照射下可以实现对蛋白质的特异性标记。为了对标记位点进行验证，将质谱鉴定的PRDX3和PRDX1组氨酸突变为丙氨酸，并在转染实验中与野生型进行比较，结果显示突变显著减少了光敏剂miniSOG对蛋白的探针标记。为了探究对蛋白的空间标记特异性，在HEK293T细胞的细胞核、线粒体基质、内质网外膜中稳定表达了miniSOG。凝胶内荧光分析显示了丰富的标记带以及三个亚细胞位置的不同标记模式，荧光成像分析显示光依赖邻近标记（photoactivation dependent proximity labeling，PDPL）具有高空间特异性。在细胞核、线粒体和内质网外膜中鉴定出1364、461和911个蛋白。为了分析细胞器定位PDPL的准确性，使用MitoCarta3.0、基因本体(GO)等分析来验证蛋白质的细胞器特异性，分别具有73.4%、78.5%、73.0%的准确性。对鉴定的线粒体蛋白进行亚线粒体分析发现，捕获的蛋白质组主要分布在基质和内膜中(226个和106个)，占鉴定的线粒体蛋白总数(362个)的91.7%，进一步证实了PDPL的高保真度。因此PDPL是鉴定细胞器特异性蛋白质组的理想工具。为了确定BRD4的蛋白相互作用图谱，在BRD4的N端或c端与miniSOG融合，给予不同时间段的光照进行激发，实验结果发现，相邻光照时间段的标记谱具有高度重复性，鉴定的蛋白质进行功能分析，主要参与染色质重塑和RNA聚合酶调控（图3）。

图3 PDPL在线粒体、内质网和细胞核中进行亚细胞蛋白质组学分析（Zhai et al., 2022）。

案例三：靶向免疫邻近标记揭示了轴突初始片段蛋白质组

题目：Immunoproximity biotinylation reveals the axon initial segment proteome

期刊：Nature Communications

IF：16.6

发表时间：2023.12

主要方法：

建立免疫邻近标记技术（immuno-proximity labeling，IPL），利用针对轴突起始段（AIS）的蛋白NF186的抗体，将过氧化物酶HRP靶向至AIS处，实现针对内源蛋白质的靶向。通过添加生物素-酚底物和过氧化氢，触发酶介导的邻近生物素化。生物素化用荧光链亲和素和免疫印迹分析来评估。通过亲和纯化富集后，生物素化蛋白用胰蛋白酶消化，并通过定量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定蛋白。

实验结果：

在抗体靶向邻近标记样品中成功富集了生物素化蛋白，而阴性对照样品则产生了可以忽略不计的信号。实验中，总共检测到2755种具有至少2种独特肽的蛋白。质谱强度在重复之间具有高度可重复性。然后，使用以下数据分析管道来完善AIS蛋白质组。首先通过比较抗nfasc样品与阴性对照的质谱强度来鉴定生物素化蛋白，得到了1403个生物素化蛋白的列表，结果包括许多已知的AIS蛋白，包括细胞外蛋白（如Brevican和Versican），细胞质蛋白（如NDEL1、LIS1、βIV-spectrin）始终排在最前面，而更广泛表达的AIS蛋白根据其在亚细胞结构域的相对表达水平进行分化，如微管蛋白TUBA4A或微管相关蛋白MAP6。为了更好地定义AIS富集蛋白，应用平均排名分数重新列出已知和推测的AIS蛋白。AIS是发育和生理动态的，为了确定AIS蛋白质组的动态发育变化，分别在DIV7、DIV14和DIV21进行了IPL-AIS，并以DIV14样品作为参考，桥接DIV7和DIV21样品。首先分析了DIV7 AIS蛋白质组获得了1407个生物素化蛋白。排名分析显示DIV7的AIS数据集的特异性，排名靠前的AIS蛋白包括AnkG、TRIM46、βIV-spectrin、NFASC和Nav1.2。在DIV21鉴定了1738个生物素化蛋白。为了确定发育过程中假定的AIS蛋白的核心集，将DIV7、14、21和先前的DIV14数据集结合起来，共生成了549个常见蛋白。其中534个蛋白在三个时间点的任意一对比较中显示20%的变化，并用于热图聚类。产生6个具有不同表达模式的簇。51.7%的蛋白在神经元发育过程中逐渐上调，4.1%的蛋白在神经元发育过程中逐渐下调。DIV21表达量最高的簇包含83.5%的蛋白质，而DIV7表达量最高的簇仅包含15.3%的蛋白质。AIS蛋白在DIV21表现出最高的表达水平，包括NFASC、AnkG、Nav1.2和βIV-spectrin，而TRIM46 随着神经元发育而下降。定量分析揭示了不同阶段之间的折叠变化和统计学意义。例如，微管相关蛋白MAP1A ，MAP6，钠/钾运输atp酶亚基α-1（Atp1a1）和酪蛋白激酶II亚基α（Csnk2a1）从DIV7到14表现出超过两倍的显著变化。从DIV14到DIV21，更多的微管或微管相关蛋白如TUBB5、TUBB3和EB3显著增加，而钙/钙调素依赖性蛋白激酶KCC2D和KCC2A也发生了两倍以上的变化。DIV7和DIV21之间的比较显示，AIS蛋白NFASC、Nav1.2 和GABA（a）受体亚基γ-2（Gabrg2）等成分增加了两倍，而TRIM46则减少了两倍，进一步证明了AIS成分在神经元发育过程中的动态性质（图4）。

图4 DIV14的轴突起始段蛋白质组（Zhang et al., 2023）。

参考文献

Ummethum H, Hamperl S. Proximity labeling techniques to study chromatin[J]. Frontiers in Genetics, 2020, 11: .

Wang P, Tang W, Li Z, et al. Mapping spatial transcriptome with light-activated proximity-dependent RNA labeling[J]. Nature Chemical Biology, 2019, 15(11): 1110-1119.

Zhai Y, Huang X, Zhang K, et al. Spatiotemporal-resolved protein networks profiling with photoactivation dependent proximity labeling[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 4906.

Zhang W, Fu Y, Peng L, et al. Immunoproximity biotinylation reveals the axon initial segment proteome[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 8201.