纯系养成——单倍体诱导技术（一）

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背景介绍

先来回顾两个概念：

杂种优势：杂种第一代在各方面均比亲本优越的现象，被广泛用于提高农作物的生产力和产量。然而，由于遗传分离，杂种第一代自交后会丧失杂种优势。此外，杂交种子生产的高成本也阻碍了许多作物中杂种优势的应用。

单倍体：单倍体（Haploid）是指细胞内具有配子染色体数目的个体，单倍体植株一般比较弱小，且表现为高度不育，只有加倍成二倍体才能恢复育性并结种，加倍后形成的株系称为单倍体加倍系（Double-Haploid，DH）。

回顾完以上概念之后，我们来聊一聊玉米育种的核心——利用杂种优势。而利用杂种优势的重要一环是选育纯系，因为纯系将作为杂交品系的亲本。

通过单倍体诱导进行的单倍体加倍育种技术（Doubled haploid breeding）是近年来兴起的一种革命性纯系育种方法，只需要两代即可得到纯合的DH系，而传统的自交方法需要6-8代才能产生纯系，因此，单倍体加倍育种技术可以大大缩短育种进程。

国外许多公司均已实现单倍体育种的规模化应用，该技术已成为可与转基因技术，分子标记辅助育种技术相媲美的现代玉米育种三大核心技术之一。

那么，如何生产单倍体呢？有下面几种方法可以参考。

组织培养：通过对花粉、子房离体培养产生单倍体，但对基因型高度依赖，组培过程中发生突变的概率高。

CENH3介导的单倍体诱导：着丝粒组蛋白3基因（CENH3）是近几年报道的创制单倍体诱导系的关键基因。想看关于这方面的文章请在评论区给置顶留言点赞喔！

单倍体诱导系诱导：与单倍体诱导系杂交会有一定概率产生母本单倍体，这种方法在玉米育种中得到了广泛应用。这也是本文将重点讲述的内容。

单倍体诱导系Stock6：

玉米是典型的二倍体植物（2n=20），自然产生单倍体的概率非常低（≈0.1%）。但密苏里大学的教授Edward H. Coe发现他的一个玉米品系Stock6在作为父本与不同的母本杂交时可产生2-3%的单倍体，因此Edward将Stock6命名为“单倍体诱导系”(Coe, 1959)。Stock6的衍生系具有7-15%的单倍体诱导率（Haploid induction rate，HIR），例如PK6、RWS、CAUHOI等。

虽然Stock6可诱导产生单倍体的现象在六十多年前就被发现，但其生物学机制仍不清楚。有一些关键的影响HIR的数量性状QTLs在前些年已经被定位：主要QTL（可解释66%的遗传变异）位于1号染色体bin 1.04的qhir1 (Prigge et al., 2012)，其定位区域已被缩小至243kb (Dong et al., 2013)；次要QTL（可解释20%的遗传变异）位于9号染色体bin 9.01上的qhir8，其定位区域已被缩小至789kb (Liu et al., 2015)。

研究单倍体诱导过程对理解染色体行为及物种进化的关系有重要价值。下面我们来看一下后续对这两个位点的精细定位以及分子机制方面的研究。

对qhir1的定位

——三个团队的白热化竞争

2017年1月23日，先正达公司（Syngenta）Timothy Kelliher团队在Nature杂志上发表了题为“MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction”的论文，该团队通过图位克隆、基因组重测序、遗传互补以及TALEN基因编辑等方法，发现玉米中的单倍体诱导是由一种花粉特异性磷脂酶基因MATRILINEAL（MTL）的移码突变造成的，该基因第四个外显子处插入了4个碱基CGAG且终止密码子提前终止（图1）。

MTL定位于花粉母细胞质中（图2）。该研究表明雄配子细胞质成分对于有性生殖过程的顺利完成、雄配子所携带染色体组在后代中的稳定传递均起到了重要的作用。

图1 玉米MTL的突变导致单倍体诱导系可诱导出单倍体(Kelliher et al., 2017)。（a、b）前人的研究检测到单倍体诱导系与分子标记Bin 1.04连锁，该团队最终将单倍体诱导基因定位到一个0.57Mb的区域，该区域包含了7个基因，最终确定了基因编号为GRMZM2G，在诱导系中，该基因插入了4个碱基CGAG且终止密码子提前终止；（c）PCR检测诱导系和非诱导系；（d）非诱导系NP2222与诱导系NP2222-HI杂交，通过转入GRMZM2G基因使其子代恢复正常育性；（e）使用TALEN技术对NP2222的GRMZM2G基因进行编辑，获得了一些碱基被删除的株系，自交分离后得到的T1代双等位纯合植株被称为MTLTAL-FS。NP2222与MTLTAL-FS杂交，二倍体子代（左）和单倍体子代（右）表型。

图2 MTL定位于花粉母细胞质中(Kelliher et al., 2017)。

2017年2月4日，中国农大陈绍江、华中农大严建兵和中国农大金危危团队在Molecular Plant杂志上发表了题为“A 4-bp Insertion at ZmPLA1 Encoding a Putative Phospholipase A Generates Haploid Induction in Maize”的论文，该团队通过转录组测序、公开数据库MaizeGDB的信息、构建细菌人工染色体文库（BAC）后再测序等方法，发现了磷脂酶A基因ZmPLA1是最有可能的qhir1区域的候选基因，与B73参考基因组相比，CAU5（由Stock6衍生的单倍体诱导系）中ZmPLA1的第四个外显子4bp碱基的插入导致20个氨基酸的改变及过早的转录终止，将蛋白截断了29个氨基酸（图3）。

随后利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除ZmPLA1进行基因功能验证，结果显示ZmPLA1敲除系对测试植株HIR的影响与Stock6相似（图3）。同时，文章也指出，不同植物的PLAs序列高度相似，可能表明它们的功能具有一定的保守性，这一点也将在后文重点讲述。

图3 通过基因编辑技术敲除ZmPLA1（GRMZM2G）来获得玉米单倍体诱导系(Liu et al., 2017)。（A）“Target”指示ZmPLA1（GRMZM2G）基因被编辑的位置；（B）野生受体系和三个T1代（ZmHIR1-1、ZmHIR1-2、ZmHIR1-3）自交系的表型；（C）野生型和T1代敲除植株之间的胚乳败育率有显著差异。

2017年2月22日，法国里昂大学植物生殖与发育实验室的Thomas Widiez团队在The EMBO journal杂志上发表了题为“Loss of pollen-specific phospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis in maize”的论文，该团队通过精细定位、构建细菌人工染色体文库（BAC）后再测序、生物信息学分析等方法，发现了磷脂酶A基因NOT LIKE DAD（NLD）是最有可能的qhir1区域的候选基因（图4）。

使用定量PCR技术检测到NLD的表达仅限于雄花穗中，启动子时空表达分析实验表明，NLD启动子在整个受精过程中是活跃的（图5）。诱导系中突变的NLD截短蛋白的错误定位，很可能是PK6诱导系能诱导单倍体的原因（图6）。

图4 对qhir1区域的精细定位，以及对NLD蛋白结构的预测(Gilles et al., 2017)。NLD外显子4中4bp碱基的插入导致其蛋白翻译移码，致使20个其它氨基酸替换了野生型蛋白质的最后49个氨基酸。

图5 NLD的时空表达分析(Gilles et al., 2017)。（A、B）通过qRT-PCR技术测定野生型A188、DH199和诱导系PK6主要组织中NLD的相对表达量；（C）将非诱导系B73中NLD上游2.6kb启动子与GUS报告基因融合（pNLD::GUS）并转入玉米，染色后，约50%的花粉粒出现蓝色，但花药中未观察到蓝色；（D、E）通过DAPI荧光可视化细胞核以确定花粉发育阶段，结果显示NLD在花粉发育的三细胞阶段和花粉粒中表达；（F）用pNLD::GUS植株的花粉对野生型植株授粉，授粉后17h观察发芽的花粉、花丝和胚珠，显示花粉管以及花粉管和胚珠交界处出现蓝色，48h后仍能观察到蓝色，但72h时消失。

图6 野生型NLD或诱导系中截短的NLD（NLD-PK6）的亚细胞定位(Gilles et al., 2017)。在花粉粒（A、B）和花粉管（C、D）中表达野生型NLD蛋白（A、C）或截短的NLD蛋白（B、D），结果显示在成熟花粉和萌发的花粉管中，野生型NLD蛋白显示出清晰的荧光信号，而截短的NLD蛋白仅观察到背景自发荧光。

伯小远的几句题外话

　大家可以看出以上三篇文章的出版时间十分接近，可见这个领域竞争之激烈！伯小远在翻阅资料时，也看到两个和文章有关的信息，分享给大家：

先正达的科学家们从2007年开始寻找负责单倍体诱导系相关的基因，在2013年他们找到了答案，并在2015年利用TALEN基因编辑系统验证了这一发现，2017年在Nature上发表文章。前后历时十年之久！

Molecular Plant这篇文章从投稿到接收只用了4天时间（1月28日投稿，1月31日接收），各种曲折可以去严建兵老师的博客上看看（
http://blog.sina.com.cn/s/blog_4abe58910102x2t9.html），其中有一句话很是动人：“感谢这次竞争，尽管竞争中我们已经落后，但因为这种落后让我看到了自己的潜力！看到了奋斗的力量，也看到了我们的未来！”

以上，共勉！

对qhir8的定位

在qhir1位置突变MTL/ZmPLA1/NLD基因能够产生大约2%的HIR，然而，这不足以解释现代单倍体诱导系约10%的HIR。因此，qhir8基因的克隆对于理解单倍体诱导的遗传基础是非常重要的。

2019年6月10日，中国农大陈绍江、赖锦盛团队在Molecular Plant杂志上发表了题为“Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize”的论文，该团队通过图位克隆将qhir8的候选基因最终锁定在ZmDMP基因，该研究还发现ZmDMP基因敲除后具有独立的诱导单倍体能力，这是首个在非stock6材料上发现的独立诱导现象。

该课题组利用其选育的高HIR诱导系CAU5和低HIR诱导系CAUHOI组配的群体进行图位克隆，将qhir8的候选基因区间缩小至318kb，并最终锁定在了编码DUF679结构域膜蛋白的基因ZmDMP，该基因编码205个氨基酸，研究团队利用基因编辑等方法验证了该基因就是单倍体诱导的关键贡献基因。研究结果表明，在ZmPLA1突变的基础上，ZmDMP起始密码子下游的第131bp上T到C的单碱基替换导致氨基酸的错义突变（图7），进而将HIR提高2-3倍。敲除ZmDMP基因后HIR为0.1-0.3%，若敲除ZmDMP同时突变mtl/zmpla1/nld基因能够将HIR增加5-6倍。

通过对ZmDMP的表达模式和亚细胞定位分析发现，该基因与ZmPLA1具有一定的相似性，均在花粉发育的后期高表达，并且定位于质膜上（图8）。表明ZmDMP与ZmPLA1有可能在单倍体诱导的过程中参与相同的通路。

该团队的发现揭示了单倍体诱导的分子机制，并为提升玉米的DH育种效率提供了新的方法。

图7 ZmDMP的精细定位以及基因编辑位点设计(Zhong et al., 2019)。（a）数量性状位点qhir8的精细定位；（b）ZmDMP基因的结构，一个碱基的突变（T→C）导致一个氨基酸发生错义突变。红色区域为编码区，灰色区域为5’和3’UTR区；（c）使用CRISPR/Cas9基因编辑系统设计的靶点位置示意图，以及基因编辑苗T0-15、T0-17的编辑类型。

图8 ZmDMP和zmdmp在各组织中的相对表达量及亚细胞定位(Zhong et al., 2019)。

小结

图9 玉米单倍体诱导机理模型(Jacquier et al., 2020)。（a）玉米种子发育是由双受精触发的，在双受精过程中，单倍体卵细胞和二倍体中央细胞分别与精子细胞融合，产生二倍体胚胎和三倍体胚乳；（b）matl/nld/zmpla1突变体与野生型杂交时，有三种类型的花粉粒，分别含有零个、一个或两个有缺陷的精细胞。因此，双受精后生成正常的籽粒、具有单倍体胚的籽粒或败育的籽粒；（c）与matl/nld/zmpla1 zmdmp双突变体花粉杂交的筛选结果表明zmdmp突变对单倍体诱导的促进作用。

在其他物种中的验证

在前面提到过，MTL/ZmPLA1/NLD基因很可能在其他作物中功能保守，所以接下来，我们一起来看看敲除这个基因在其他植物中是否像在玉米中那样，也能用于诱导单倍体呢？DMP单倍体诱导基因又能否在其他植物中应用呢？为了加强大家的记忆和理解，伯小远在这里再次给大家讲解一遍得到单倍体系的方法，敲除与单倍体诱导有关的基因得到突变体，然后将突变体与野生型进行杂交就可以得到单倍体系了。

水稻-MTL

2018年7月10日，先正达公司（Syngenta）Timothy Kelliher和Gayatri Sahoo团队在Nature Plants杂志上发表了题为“OsMATL mutation induces haploid seed formation in indica rice”的论文，该研究发现将水稻中玉米ZmMTL的同源基因OsMATL突变后，株系的结实率下降，突变植株还可以诱导单倍体种子的形成，其HIR约为6%。该团队的研究为水稻育种提供了新的思路。

图10 OsMATL编辑载体以及突变体的子代(Yao et al., 2018)。（a）基因编辑载体示意图；（b、c）正常二倍体（左）和单倍体（右）在播种4周和3个月的生长情况比较；（d）流式细胞仪检测是否为单倍体；（e）对二倍体、单倍体植株叶片长度、叶片宽度、植株高度、分蘖数的比较。

水稻-MTL

2019年1月4日，中国农科院王克剑和巴黎萨克雷大学Raphael Mercier团队在Nature Biotechnology杂志上发表了题为“Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes”的论文，该团队通过定向编辑水稻的四个内源基因REC8、PAIR1、OSD1和MTL，成功获得了具有无融合生殖现象的材料，并获得与杂交亲本基因型一致的克隆种子，实现了F1杂交水稻的杂合性状的固定，无需额外的杂交就可以直接繁殖育种。如果对这方面感兴趣的话，可以专门找这篇文献看一下噢，我们在本文不做过多讲述，只关注通过编辑水稻的OsMTL基因是否也能产生在玉米里一样的效果，答案依然是Yes！

图11 通过编辑杂交水稻品种春优84（CY84）中的OsMTL基因生产单倍体诱导系(Wang et al., 2019)。（a）基因编辑载体示意图；（b）野生型与mtl突变体的穗型比较；（c）用12个Indel标记来区分单倍体、DH或重组自交系（RID）；（d）流式细胞仪检测是否为单倍体；（e）全基因组测序区分单倍体、DH或RID；（f）CY84、RID、单倍体和DH子代的穗型比较。

小麦-PLA

2019年7月25日，中国农大陈绍江团队在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了题为“Extension of the in vivo haploid induction system from diploid maize to hexaploid wheat”的论文，该团队通过同源基因克隆、基因编辑的方法，成功获得了小麦磷脂酶基因TaPLA的突变体，该基因的突变并不影响小麦的生长发育及花粉活力，该突变体的HIR为5.88%-15.66%。

图12 在小麦中敲除MTL/ZmPLA/NLD的同源基因可引起单倍体诱导(Liu et al., 2020a)。在小麦中有三个MTL/ZmPLA/NLD的同源基因，分别位于A、B和D基因组上，利用CRISPR编辑系统对第一外显子进行编辑（a），成功获得了小麦TaPLA突变体。将T1代TaPLA突变体的与中国春杂交后发现出现了单倍体，将单倍体（H）与六倍体（HE）小麦进行表型比较，包括株型、叶、穗和花药（b）。

小麦-MTL

2019年11月24日，中国农业科学院作物科学研究所叶兴国、王轲团队在Journal of Experimental Botany杂志上发表了题为“Efficient induction of haploid plants in wheat by editing of TaMTL using an optimized Agrobacterium-mediated CRISPR system”的论文，该团队比较了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1和CRISPR/xCas9在小麦中的编辑效果，发现CRISPR/Cas9的突变频率最高，并利用优化的CRISPR/Cas9编辑系统对小麦内源基因TaMTL进行了编辑，TaMTL-4A和TaMTL-4D的双基因敲除突变导致HIR为10%，TaMTL-4A、TaMTL-4B和TaMTL-4D的三基因敲除突变导致HIR为11.8-31.6%。该研究对小麦单倍体育种具有良好的实际应用价值。

图13 利用CRISPR/Cas9编辑系统创制小麦单倍体诱导系(Liu et al., 2020b)。（a）基因编辑载体示意图；（b）野生型Fielder（1）与TaMTL编辑植株（2、3）的穗型比较；（c）对野生型Fielder（F）和TaMTL编辑植株（QD33-3、QD33-14和QD33-26）中TaMTL基因表达量的检测；（d、e）与野生型（d3、e3）相比，编辑植株产生了一些没有胚（d1、d2）或胚乳（e1、e2）的种子。

拟南芥-DMP

2020年5月15日，中国农大陈绍江、刘晨旭团队在Nature Plants杂志上发表了题为“A DMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in the dicotyledonous Arabidopsis”，该团队通过对拟南芥中ZmDMP同源基因DMP8和DMP9进行敲除，获得了不同编辑类型的dmp突变体，这些突变体具有单倍体诱导功能，HIR约为1-4%。该研究首次将玉米单倍体的诱导体系拓展至双子叶植物。

图14 突变拟南芥DMP基因(Zhong et al., 2020)。（a）基因编辑载体示意图；（b）基因DMP8和DMP9的靶点设计以及突变体的序列；（c、d）Col-0、dmp8、dmp9和dmp8 dmp9的角果、种子数量比较；（e）dmp8 dmp9突变体显示出未发育的胚珠（红色箭头）、退化的种子（黄色箭头）和正常种子（白色箭头）；（f）对不同种子数量的统计；（g）单倍体与二倍体植株的表型比较；（h）流式细胞仪检测是否为单倍体。

蒺藜苜蓿-DMP

2021年10月26日，中国农科院林浩团队在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了题为“In planta haploid induction by genome editing of DMP in the model legume Medicago truncatula”，该团队通过基因编辑技术对蒺藜苜蓿A17中ZmDMP同源基因MtDMP8和MtDMP9进行敲除，dmp8 dmp9双突变体具有单倍体诱导功能，其HIR为0.29-0.82%。该研究首次将玉米单倍体的诱导体系拓展至豆科植物。

图15 突变蒺藜苜蓿DMP基因(Wang et al., 2021)。（a）基因MtDMP8和MtDMP9的靶点设计以及突变体的序列；（b）dmp突变体与野生型植株杂交后子代的花粉活力测试；（c）对种子数量的统计；（d）流式细胞仪检测是否为单倍体；（e、f）野生型二倍体与单倍体植株的表型比较，包括整株、叶、花、花药和花粉；（g）对不同形式的杂交组合下HIR的统计；（h）单倍体表型更接近其母本A17。

单倍体诱导系统拓展至其他物种的研究思路总结

伯小远叨叨

现在我们来回顾一下本文所讲的内容，主要是对玉米中两个与单倍体诱导有关的QTLs位点qhir1和qhir8进行精细定位，最终图位克隆出MTL/ZmPLA1/NLD基因和DMP基因，而由于这些基因的保守性，它们在其他植物中被突变后也具有单倍体诱导功能。至此，以诱导基因为基础的母本单倍体诱导系统在重要的粮食作物及牧草上均已获得验证，有望成为主要农作物纯系创制与性状快速改良的关键技术。伯小远就不一一列举更多在其他物种中的应用了，欢迎大家来补充喔！

References：

Coe, Jr., 1959. A Line of Maize with High Haploid Frequency. The American Naturalist 93, 381.

Dong X, Xu X, Miao J, et al., 2013. Fine mapping of qhir1 influencing in vivo haploid induction in maize. Theor Appl Genet 126, 1713-20.

Gilles LM, Khaled A, Laffaire JB, et al., 2017. Loss of pollen-specific phospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis in maize. EMBO J 36, 707-17.

Jacquier NMA, Gilles LM, Pyott DE, Martinant JP, Rogowsky PM, Widiez T, 2020. Puzzling out plant reproduction by haploid induction for innovations in plant breeding. Nat Plants 6, 610-9.

Kelliher T, Starr D, Richbourg L, et al., 2017. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction. Nature 542, 105-9.

Liu C, Li W, Zhong Y, et al., 2015. Fine mapping of qhir8 affecting in vivo haploid induction in maize. Theor Appl Genet 128, 2507-15.

Liu C, Li X, Meng D, et al., 2017. A 4-bp Insertion at ZmPLA1 Encoding a Putative Phospholipase A Generates Haploid Induction in Maize. Mol Plant 10, 520-2.

Liu C, Zhong Y, Qi X, et al., 2020a. Extension of the in vivo haploid induction system from diploid maize to hexaploid wheat. Plant Biotechnol J 18, 316-8.

Liu H, Wang K, Jia Z, et al., 2020b. Efficient induction of haploid plants in wheat by editing of TaMTL using an optimized Agrobacterium-mediated CRISPR system. J Exp Bot 71, 1337-49.

Prigge V, Xu X, Li L, et al., 2012. New insights into the genetics of in vivo induction of maternal haploids, the backbone of doubled haploid technology in maize. Genetics 190, 781-93.

Wang C, Liu Q, Shen Y, et al., 2019. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes. Nat Biotechnol 37, 283-6.

Wang N, Xia X, Jiang T, et al., 2021. In planta haploid induction by genome editing of DMP in the model legume Medicago truncatula. Plant Biotechnol J.

Yao L, Zhang Y, Liu C, et al., 2018. OsMATL mutation induces haploid seed formation in indica rice. Nat Plants 4, 530-3.

Zhong Y, Chen B, Li M, et al., 2020. A DMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in the dicotyledonous Arabidopsis. Nat Plants 6, 466-72.

Zhong Y, Liu C, Qi X, et al., 2019. Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize. Nat Plants 5, 575-80.

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