酶催化效率的改造中常规方法效果一般,Uaa引入则打开了一条道路

酶催化效率的改造中常规方法效果一般,Uaa引入则打开了一条道路基于筛选压力掺入Uaa其依赖一种或多种特定的天然氨基酸营养缺陷型宿主,将营养缺陷型菌株先在含有一定量Naa的培养基中培养。当相应的Naa消耗完,

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基于筛选压力掺入Uaa其依赖一种或多种特定的天然氨基酸营养缺陷型宿主,将营养缺陷型菌株先在含有一定量Naa的培养基中培养。

当相应的Naa消耗完,并且细胞达到适当的生长状态可以表达重组蛋白时,补加与Naa结构和电荷特性类似的Uaa。

由于天然氨基酸内源氨酰tRNA合成酶不能严格区分Naa以及其类似物而存在错氨酰化,在筛选压力的作用下通过诱导型启动子诱导基因的表达使蛋白质翻译依赖于Uaa的可用性,从而将其掺入到蛋白质中。

到目前为止,已经约有50种Uaa通过这种方法整合到了蛋白质中。

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改变筛选压力可能会导致蛋白质插入Uaa的位点发生改变,这种情况会导致累积和协同效应,这些效应的产生对某些蛋白质性能的改变更明显于单一位点的改变。

但也导致了该方法无法广泛的应用在更精细准确的研究中,同时这种方法需要大量成本高昂的Uaa,这些缺点都导致了这种方法无法实现工业化的应用。

通过扩展遗传密码或者开发替代密码的方法,将Uaa掺入到蛋白质中,对此需要有新的密码子和相应互补的反密码子,通过体外和体内的翻译系统将新氨基酸掺入到蛋白质中,该方法重点是创建新的密码子和反密码子的相互作用,包括用于遗传字母ATCG(U)扩增的非天然碱基对系统。

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美国斯克利普斯研究所Schultz教授等率先在前人研究上,利用古生菌属詹氏甲烷球菌(Methanococ-cusjannaschii,Mj)tRNATyr/TyrRS对与大肠杆菌自身tRNAs/aaRSs对正交即MjTyrRS不识别大肠杆菌tRNAs,大肠杆菌aaRSs也不识别MjtRNATyr这一特性,开发出了一种新的Uaa修饰蛋白质方法,。

在蛋白质的翻译机制中增加新的部件,对目标蛋白质修饰位点的基因进行突变,然后校正MjTyrRS氨酰化特异非天然氨基酸装载到校正MjtRNA上,氨酰化的校正MjtRNA与目标mRNA突变位点密码子结合,翻译出含有特异非天然氨基酸的蛋白质。

除此之外,研究表明在大肠杆菌中创建的吡咯赖氨酸-tRNA合成酶/tRNACUAPyl对系统可用于扩展酿酒酵母的遗传密码。

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使用这种系统,在酵母蛋白中成功掺入了多种Uaa如Nε-[(2-丙炔氧基)羰基]-L-赖氨酸、Nε-乙酰基-L-赖氨酸,其中掺入的一种光笼氨基酸已被证明可用于控制真核细胞中蛋白质的功能。

这种方法将允许越来越多的有用氨基酸同吡咯赖基-tRNA合成酶/tRNACUAPyl对一起掺入到酵母细胞蛋白质中。

这种方法还可以绕过直接在真核宿主中进化合成酶的氨基酸特异性要求将非天然氨基酸转移到哺乳动物细胞蛋白质中。

扩展遗传密码或者开发替代密码的方法在修饰中采用的Uaa与天然氨基酸结构类似,不仅避免了普通化学修饰中修饰位点选择的被动性,并且最大限度地保证了酶蛋白的结构稳定和活性保留。

酶催化效率的改造中常规方法效果一般,Uaa引入则打开了一条道路

在酶催化效率的改造中使用常规方法很多时候效果一般,而Uaa的引入则为此打开了一条新的道路。

细菌磷酸三酯酶催化农药对氧磷水解,其催化效率十分高效已经被认为达到了该酶的进化极限,在使用UaaL-(7-羟基香豆素-4-基)乙基甘氨酸或L-(7-甲基香豆素-4-基)乙基甘氨酸取代该酶的309位天然酪氨酸后,这种酶的活性在已经非常高效的情况下仍然增强了8~11倍。

而相比之下,从数十万种天然氨基酸突变体中筛选获得提高天然活性的酶显得十分的困难且低效。

氟化氨基酸的掺入还可以显著增强酶的热稳定性,借助微生物的培养,获得的对氟苯丙氨酸磷酸酯酶在60℃的高温下仍可正常行驶功能而不受任何影响,但一般的天然酶则在该温度下则氢键会发生断裂而失去酶的活性和功能。

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蛋白质的生理功能以及分子机制等大多体现在其动态结构的变化之中,对于蛋白质的动态分析在研究中自然是十分关键的。

核磁共振是一种可以获得蛋白质动力学信息的重要方法,但在超大蛋白体系中,由于谱峰数量多、图像展宽、分辨率低等问题仍然影响蛋白质构象的获取,通过将Uaa引入蛋白质的关键位点并观测Uaa的核磁共振标记就可以很好的解决这些问题。

孙金鹏教授开发了通过遗传密码扩展将4-三甲基硅基苯丙氨酸(TMSiPhe)在特定位点掺入蛋白质中用于检测生物系统中构象变化的DeSipher方法,利用UaaTMSiPhe上待观测氢原子在核磁共振中特有的化学位移和灵敏度检测蛋白构象的变化。

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G蛋白偶联受体(GPCR)是人体中的一类膜受体家族,负责着人体五分之四的跨膜信号转导,能够识别信号刺激,通过G蛋白和调节蛋白arrestin转化为胞内信号,其中GPCR需经过磷酸化并通过不同的磷酸化模式招募并诱导arrestin产生多种构象从而指导不同的功能,但受体是否可以不经过磷酸化直接与配体结合,同时配体直接通过改变受体的构型来对arrestin的功能进行特异性的调控是一直以来难以解决的问题。

在应用DeSipher技术后,成功检测到GPCR与不同配体结合后调控下游arrestin蛋白的多重构象状态,证明了多种配体可以直接与GPCR的跨膜核心作用并在不依赖对相关磷酸化酶的选择下调控改变下游调控蛋白的构象进而介导下游不同的功能。

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在大分子量蛋白中插入Uaa,通过大幅减少蛋白质中可观测信号的数量进而降低信号的分类难度,获得简化后的核磁共振图谱,大大降低了核磁共振在蛋白质特定功能域动态研究的难度。

这种方法在日后一定会逐渐发展成熟并成为核磁共振研究中的一种有力手段。

Uaa的出现给生物医药也带来了一份新的可能性,传统医药的开发主要通过筛选现有的化合物库,但很多蛋白质药物很难通过化学合成来获得,缺乏对蛋白质药物的设计和改造。

Uaa有着特殊的化学基团,这些基团可以给蛋白类药物带来新的空间结构,显著拓展蛋白药物的设计空间。

常规药物主要由天然氨基酸通过非共价相互作用发挥疗效,具有结合不够稳定、容易解离而导致药效不理想的局限性,相比之下共价蛋白药物有着更大的治疗潜力。

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科学家在开发共价蛋白药物的时候,将一种具有活性的Uaa氟硫酸盐-L-酪氨酸(FSY)掺入到人程序性细胞死亡蛋白PD-1中,这种蛋白由T细胞表达可以调节T细胞的活性,在肿瘤细胞中常过表达其受体蛋白PD-L1,该受体蛋白与T细胞表面PD-1结合相互作用抑制T细胞活性并引起肿瘤特异性T细胞凋亡,阻断两者的结合便可以有效逆转受阻的抗肿瘤免疫应答。

最主要的方法是注射相同结构PD-1蛋白的竞争疗法,FSY具有潜在的生物反应性,在体内和蛋白质中呈现惰性,在蛋白质药物与靶标蛋白结合后,药物上连接的FSY接近靶标蛋白天然残基,并与该残基发生特异性的不可逆共价结合。

在免疫人源化小鼠的过程中共价修饰后的PD-1(FSY)比一般的PD-1(G)对于治疗肿瘤细胞有更显著的效果。

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Uaa引入自体蛋白还可以克服机体的自我耐受性,免疫系统对自身抗原的自我耐受性使得对癌症或慢性退行性疾病的治疗性疫苗生产变得十分困难[38],引入Uaa则是一种简单却有显著效果的方法。

对于Uaa的合成目前已经有了很多较为可行的途径,尤其是生物细胞代谢工程的开发有着传统化学合成法所无法企及的优势。

同时关于Uaa插入蛋白质的课题一直是研究的热点,目前已经有化学修饰、筛选压力以及遗传密码扩展的技术可以插入Uaa以定向修饰改造蛋白质。

由于Uaa区别于Naa的独特的理化性质,Uaa修饰蛋白质可以带来较大的性能改变,有望获得符合期望的高性能蛋白质,进而满足当今科技、工业、医疗等发展的需求。

Uaa的插入,对于酶类物质的改造、蛋白药物的开发、生物医疗的发展等都有着前所未有的效果,在不久的未来Uaa及其修饰蛋白一定还会应用到更多的方面,为人类社会的发展做出更大的贡献。

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