基于ELVEFLOW微流控技术在病原微生物检测中的研究进展

快速、准确地检测病原微生物对于疫情防控和保障人民生命健康具有重大意义。近几年，研究者们通过合理地设计微流控芯片，将Elveflow微流控技术与各种检测技术相结合，已经开发出了多种用于病原微生物检测的技术方法。相较于传统的病原微生物检测技术，Elveflow微流控检测技术优势突出，具有操作人员技术要求不高、样本需求量少和自动化程度高等优点，适用于各种复杂环境下病原微生物的精准、快速检测。本文对Elveflow微流控技术在病毒、细菌、真菌、衣原体及支原体等病原微生物的检测应用进行了综述，以期为病原微生物的检测提供研究思路，促进微流控技术在病原微生物检测中的发展，提高对疾病的预防和控制能力。

微流控（microfluidics）指的是使用微管道（尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术。Elveflow微流控系统通常包含阀门、微通道、反应室、压力系统和检测系统，通过控制微流控装置内流体的运动来实现样品制备、反应、分离和检测等功能。Elveflow微流控技术能够控制微小流体，整合多种反应，其在病原微生物检测中可以在微观水平上精确控制样品体积并减少体内和体外环境之间的差异，进而达到缩短反应时间和降低检测成本的目的，具有快速、准确、样品消耗少等优点，为病原微生物的检测提供了广阔的前景。

基于Elveflow微流控技术的病毒检测方法主要针对病毒细胞数量、表面特异性蛋白和特异性核酸片段来开展检测。基于病毒细胞培养的空斑测定法是病毒鉴定和诊断的金标准，但存在通量低、所需样品量大等问题，因此 Su 等设计了可以同时培养5种病毒的聚二甲硅氧烷芯片，该芯片系统不仅实现了病毒的高效鉴定，还完成了病毒的分离和抗病毒药物的筛选，具有通量高和检测样本量少的优点。

为了在Elveflow微流控检测系统中实现对多靶标蛋白的灵敏识别，Guan 等设计了一个集成两种单克隆抗体（mAb）的微流体系统，用于肠道病毒71（EV71）的灵敏检测。该系统将EV71 的主要衣壳蛋白VP1 的单克隆抗体1F4 和2H2 分别与羧基官能化磁珠和羧基官能化量子点偶联，最后通过荧光强度来直接评估靶标蛋白的浓度。该微流体系统在30 min 内对VP1 的检测限（LOD）达到10pg/mL，与使用相同抗体的夹心酶联免疫吸附试验的结果（310 pg/mL）相比，提升了31 倍。

细菌是许多疾病的病原体，可以通过皮肤、消化道、呼吸道、血液等方式传播疾病，具有较强的传染性。快速、高灵敏、高特异性的病原菌现场检测已成为迫切需要，现有的细菌检测方法存在操作繁琐、耗时长等问题，无法满足即时检测的需求；微流控芯片技术由于其小型化、便携性好和低试剂消耗，为各分析物提供了一种方便、快捷的检测工具。

为了进一步提高灵敏度，Kao 等研究了一种新型的微流控免洗荧光原位杂交（FISH［24］）液滴检测系统。其将样品与试剂混合并装入微流体盒中，通过离心使微流体乳化，将样品制成微液滴用于细菌包封，使用锁定核酸的LNA/DNA 分子信标和基于NaCl 尿素的杂交缓冲液，然后进行原位渗透、杂交和信号检测。该检测系统以大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌为对象进行验证，检测限为3×103 bacteria/mL，该系统达到单细胞灵敏度水平。

真菌感染可导致严重的临床结果，如引发多器官衰竭和感染性休克，因此对真菌的快速检测是治疗真菌感染疾病的关键。常规真菌检测方法包括血培养、平板培养和聚合酶链式反应，这些方法普遍存在耗时长、需要昂贵设备等问题。随着Elveflow微流控芯片技术的发展，科学家将微流控芯片与真菌检测相结合，实现了更高的检测效率和准确性。Soares等报道了一种新型的超快速单步荧光竞争性免疫分析方法，利用Elveflow微流控室中固定的、经功能化纳米多孔琼脂糖珠修饰的蛋白质来检测黄曲霉素B1，检测时间为2 min，检测限为1 ng/mL。为了实现对真菌的灵敏检测，Schell 等开发了一种数字微流控实时PCR 平台，用于检测血液中白色念珠菌的DNA，与金标准法相比，总灵敏度达到94%。随着各种真菌毒素特异性单克隆抗体的开发以及针对单一或多种真菌毒素的免疫亲和柱的建立，Elveflow微流控芯片高通量、高灵敏度、灵巧和快速的优势将在真菌的同步检测中更加突出。

从整个微流控技术领域的发展角度来，未来随着材料科学与电子测量技术的发展，多重信号放大融合的多靶标检测的微流控平台可能开辟出更有发展应用前景的POCT 新途径：（1）多纳米技术与新材料的融合。临床诊断和环境监测中的许多样品都比较复杂，其中存在多种不同的物质，由于背景信号较强，可能会干扰检测过程。集成先进的纳米技术有利于样品的富集，同时选择用于信号转换的材料可以大大提高微流控传感的效率。（2）同时分析多种不同类型重要生物标志物。在临床诊断、治疗和预后中，进行多靶标检测以确保准确评估是必不可少的。因此，将蛋白质、核酸等多种生物标志物的检测以全自动的方式整合到一个平台上，不仅可以在不同层面提供有价值的疾病信息，提高检测的可信度，还可以促进POCT 的实际应用。合理设计的Elveflow微流控芯片，结合先进的检测技术和多功能材料，有望实现广泛的临床应用。

法国Elveflow 专注于微流控仪器及系统的开发制造，以多通道的OB1 压力控制器为主要设备，结合MFS 流量传感器，MPS 压力传感器，MUX recirculation 循环阀，MUX distribution 分配阀等构建成套的微流控应用系统，其中微流控动态细胞培养系统及微流控细胞灌注培养系统用于是用于细胞培养的微流控系统。

微流控细胞培养是采用微流控系统在微流控芯片中进行的动态细胞培养，微流控细胞培养芯片的尺寸适合细胞的尺寸，因此被用于动态细胞培养中。微流控细胞培养的关键能够模拟细胞微环境，采用微流控进行细胞培养的优势有增加系微环境的生理相关性，将尺度缩小到组织的规模，创建复杂的共培养体系，施加动力和机械力，增加组织界面的模拟水平，减少药物测试的动物实验模型，模拟血液、淋巴和间质液体的流动等。

法国Elveflow采用微流控系统进行细胞培养的应用案例有：

• 微流控芯片上的细胞相互作用研究
• 采用微流控系统进行研究细菌对压力和环境变化的适应性
• 采用微流控循环阀进行细胞培养的培养基的再循环
• 动态细胞培中细胞培养的循环
• 如何在微流控芯片中进行动态细胞培养的细胞染色
• 微流控动态细胞培养中细胞培养基灌注
• 微流控动态细胞培养中自动化细胞接种
• 微流控心肌细胞培养模型
• 采用微流控细胞培养灌注系统进行快速细胞培养基的切换
• 用于微流控qPCR的荧光读取
• 采用微流控系统进行循环肿瘤细胞的捕获
• 微流控芯片上活细胞检测
• 采用微流控压力泵进行弱蛋白结合的定量

微流细胞培养中采用的OB1 多通道压力泵的参数：

OB1 微流控压力和流量控制器可以选择1-4个通道或者更多通道，每个通道的压力和真空范围可选，5个可选的范围为：0-200mbar, 0-2000mbar, 0-8000mbar, -900-1000mbar, -900mbar-6000mbar. 具有模块化，可升级的特点，采用Elveflow ESI 软件进行控制。

OB1 微流控压力和流量控制器的性能参数：

• 压力稳定性0.005% FS
• 相应时间9ms
• 压力分辨率0.003%FS
• 稳定时间低于35ms

OB1 微流控压力和流量控制器可用于数字微流控，流动化学&聚合物合成，细胞培养中的细胞灌注，细胞培养液的顺序注射，单液滴测序，RNA 测序，芯片实验室，器官芯片等应用。