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原核Ago蛋白（Prokaryotic Argonautes, pAgos）利用小DNA作为向导序列，特异性切割与其互补的DNA单链，被认为有潜力开发为可编程DNA切割工具。然而，pAgos无法使双链DNA解旋，这意味着只有事先将DNA链分开，pAgos才能对双链靶标进行切割。有研究报道来自激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）的PfAgo能够在87℃下，通过使用2个引导序列能够实现双链DNA的可编程切割，然而这实际上是依赖高温使DNA变性，且高温限制了该工具的实际应用。
近日，来自NEB（New England Biolabs）公司的Jurate Bitinaite课题组在《Nucleic Acid Research》期刊上发表文章“Programmable cleavage of linear double-stranded DNA by combined action of Argonaute CbAgo from Clostridium butyricum and nuclease deficient RecBC helicase from E.coli ”，将DNA解旋酶和CbAgo进行组合，实现了在体外对线性双链DNA的可编程切割。首先研究利用生信分析筛选出6种可能能够在37℃工作的pAgos进行生化表征，发现来自丁酸梭菌（Clostridium perfringens ）的CbAgo具有最高的单链DNA切割活性。接着，研究测试了来自大肠杆菌的解旋酶RecQ和无核酸酶活性的复合体RecBexo-C，发现在RecQ存在下，DNA长度增加至60-100bp时CbAgo的切割活性大大下降，而RecBexo-C存在时，CbAgo能够完全切割30-100bp的双链DNA。接下来，研究使用两条交错互补的ssDNA guide使两条链的切割位点之间间隔几个碱基，这使得切割产物含有5’突出或3’突出的粘性末端，并探究两个切割位点之间间隔碱基的数量、CbAgo:guide比值对切割活性的影响，结果发现，当切割位点间隔5-8nt且会形成5’突出末端时CbAgo的切割活性大大降低，而过剩的游离ssDNA guide会显著降低CbAgo的切割活性。研究进一步使用线性化后的质粒证实CbAgo能够特异性切割11-12.5kb的线性DNA双链。最后，利用两个DNA guide产生粘性末端的特性，研究探究了将组合RecBexo-C的CbAgo开发为DNA组装工具以实现片段PCR-free的无缝组装。
综上，研究通过将来自大肠杆菌的解旋酶RecBexo-C与来自丁酸梭菌的CbAgo进行组合，实现了在37℃下长达11-12.5kb的线性双链DNA的可编程切割，这是目前报道的活性最高的DNA引导的双链DNA切割/切刻，基于这一研究或许能开发出更多的诊断和合成生物学工具。
（周晓杰 摘译）
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