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快律宁(KLN)是杨传华教授自拟方，由黄连、生地、苦参、当归、酸枣仁、柏子仁组成，具有清心火、养心阴、安心神的作用。
临床研究表明其对室性心律失常具有良好的疗效和安全性，且停药后复发率低，但其作用机制研究尚待深入。
钾离子通道在室性心律失常的发生中起重要的作用。
KLN中的黄连、苦参、生地均对钾离子通道有一定的作用。
笔者通过全细胞膜片钳技术测定KLN对心室肌细胞膜上延迟整流钾电流(IK)及内向整流钾电流(IK1)的影响，以期揭示其抗心律失常作用的部分机制。
健康成年豚鼠，雌雄不拘，体重250～350g，由济南西岭角养殖繁育中心提供。
快律宁胶囊(KLN)由江苏江阴药业有限公司生产，批号：20110920。
Ⅱ型胶原酶(Gibco公司，美国)。
膜片钳放大器(Axopatch700B，Axon公司，美国)，三维式液压微操纵器(MP-225，Sutter公司，美国)，A/D和D/A转换器(Digidata1440A，Axon公司，美国)。
正常台氏液(mmol/L):NaCl137、KCl5.4、MgC12 1.0、NaH2PO4 0.33、HEPES10、Glucose10、CaCl2 1.0，用NaOH调PH至7.4。
无钙台氏液(mmol/L)为正常台氏液不添加CaCl2。
KB液(mmol/L):KOH70、KCl40、KH2PO4 20、MgCl2 3、谷氨酸50、牛磺酸20、EGTA1、HEPES10、Glucose10，用KOH调PH至7.35。
记录IK1细胞外液：为正常台式液中加入0.1mmol/LCdC12以阻断钙电流。
记录IK细胞外液：为正常台式液中加入0.1mmol/LCdC12以阻断L型钙电流，加入1mmol/LBaC12以阻断IKl电流。
电极内液(mmol/L):KCl140、HEPES5、MgCl2 0.5、K2-ATP4、EGTA10，用KOH调PH至7.2，用0.22μm微孔滤膜过滤。
KLN溶液：取胶囊内的干粉，以IK、IK1相应细胞外液配制溶液，用NaOH调PH至7.4，离心后弃去杂质，取上层溶液，再以双层滤纸过滤，即配即用。
参照文献方法分离单个豚鼠心室肌细胞：取出心脏并迅速悬挂于Langendorff离体心脏灌流装置(四川成都泰盟科技有限公司)上，经主动脉行逆行灌流；循环水浴保持灌流系统恒温(37℃±0.5℃)，流速6～8mL/min，各灌流液及KB液均先使用含95%O2+5%CO2的混合气饱和15min以上，灌流过程中持续通入混合气，灌流压约70cm水柱。
以无钙台氏液灌流3～5min，其后以含胶原酶Ⅱ(0.4mg/ml)和BSA(1mg/ml)的无钙台氏液循环灌流约15～25min，观察心脏呈粉红色略透明，较灌流前膨大、松软，停止消化。
以KB液继续灌流约5min冲洗残酶；将心脏取下置于37℃KB液中，剪下心室肌部分并剪碎至1mm3小组织块，吹打3min;以100目不锈钢筛网过滤，低速离心(500r/min)40～60s。
弃上清液，加入KB液，在室温下静置孵育40～60min待用。
分离好的细胞置于4℃冰箱中保存，于12h内可保持良好状态。
本实验采用全细胞膜片钳记录方式。
刺激信号及电压、电流输入信号的采集均由软件Clampex10.2控制。
玻璃电极由玻璃微电极拉制器(p-97，Sutter公司，美国)经两步拉制法拉制而成，并以玻璃微电极抛光仪(2002-C，武汉东山新技术应用研究所)进行抛光，从尾部灌充电极内液，入水电阻约为2～4MΩ。
实验在室温(22℃～27℃)下进行，所有细胞外液均以含95%O2+5%CO2的混合气饱和15min以上。
为避免通道电流的衰减现象对实验结果产生影响，电极内液添加K2-ATP，并控制实验在细胞破膜后30min内完成。
采用Hamill等的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳制模式下记录各种通道电流。
细胞破膜后稳定5min，记录给药前电流值。
依次给予低(2.5mg/ml)、中(5mg/ml)及高(10mg/ml)剂量KLN，于细胞外灌流药物5min后，依次记录各剂量给药后电流值。
以正常细胞外液冲洗细胞洗脱药物5min，记录冲洗后电流值。
记录IK电压依赖性激活刺激方案：保持电位为-40mV，测试电压从-40mV开始，阶跃刺激至+50mV，步阶为10mV，波宽设为5000ms，采样频率2kHz。
测定各阶跃电位下的IK峰值幅度及IK尾电流(IK，tail)幅度，绘制电流密度-电压(I-V)关系曲线。
记录IK时间依赖性激活刺激方案：保持电位-40mV，从-40mV给予一个+50mV的测试电压，保持500ms，再回到-40mV，此时可记录到IK尾电流，共给予10个连续的脉冲刺激，自第一个刺激时程500ms开始，每一刺激时程以500ms的幅度递加，直至最后一个刺激的时程达5000ms，采样频率2kHz。
刺激方案为：保持电位设为-40mV，测试电压从-120mV开始，阶跃刺激至+0mV，步阶电压为10mV，钳制时间设为400ms，采样频率2kHz。
原始电流数据采用Clampfit10.2软件进行测量和分析，SigmaPlot10.0软件作图，电流值以电流密度(pA/pF)表示。
应用SPSS19.0进行统计分析，计量资料以x¯±s表示，采用同一细胞给药前后自身对照，应用配对t检验，以P<0.05为差异有显著性。
低、中、高剂量KLN作用5 min后均可使时间依赖性激活的外向电流IK及IK，tail电流幅度降低，随剂量增加作用增强，冲洗相同时间(5 min)可使电流有所恢复。
测量去极化刺激末电流值并以细胞膜电容校正为电流密度，以各去极化测试电压为横坐标作图，得IKI-V关系曲线，KLN作用使曲线下移。
尾电流包裹程序中，KLN剂量依赖性抑制IK，tail，冲洗可使电流恢复到(2.18±0.49)pA/pF。
以IK，tail电流峰值对不同的刺激时间作图得时间依赖性曲线，各剂量KLN均使曲线下移，以高剂量组下降最为显著。
|
类别 |
n |
IKs/(pA/pF) |
IKs， tail/(pA/pF) |
对IKs， tail的抑制率/% |
|
给药前 |
6 |
5.76±1.43 |
2.89±0.55 |
— |
|
低剂量KLN组 |
6 |
4.50±1.17** |
2.52±0.36* |
12.01±5.55 |
|
中剂量KLN组 |
6 |
2.26±0.54** |
1.80±0.38** |
36.40±15.40 |
|
高剂量KLN组 |
6 |
1.16±0.35** |
1.32±0.42** |
52.68±17.50 |
|
类别 |
n |
IK，tail/(pA/pF) |
抑制率/% |
|
给药前 |
6 |
2.78±0.44 |
— |
|
低剂量KLN组 |
6 |
2.18±0.52** |
21.98±9.38 |
|
中剂量KLN组 |
6 |
1.80±0.56** |
35.89±13.64 |
|
高剂量KLN组 |
6 |
1.46±0.35** |
47.48±10.14 |
内向电流在-120 mV电压刺激时达到最大，以测试电压-120 mV引出的电流值作为观察指标，外向电流以电流峰值为观察指标。
低剂量KLN使IK1略增大，但无统计学意义(P>0.05);中、高剂量KLN可显著降低IK1内向电流(P<0.01);高剂量KLN对IK1外向电流有抑制作用(P<0.05)。
冲洗后IK1内向电流恢复到(-12.35±2.31)pA/pF，IK1外向电流恢复到(1.44±0.96)pA/pF。
IK1反转电位在-60 mV左右，KLN未改变曲线形态及通道内向整流特性。
曲线无明显的左右移动，反转电位略左移，变化不显著。
中、高剂量KLN使IK1内向电流部分的I-V曲线显著上移、外向电流部分曲线下移，即具有使IK1内、外向电流均减小的趋势。
类别 |
n |
IK1内向电流 |
IK1外向电流 |
|
给药前 |
7 |
-12.93±1.85 |
1.48±0.84 |
|
低剂量KLN组 |
7 |
-13.14±1.83 |
1.60±1.01 |
|
中剂量KLN组 |
7 |
-11.98±2.13** |
0.90±0.27 |
|
高剂量KLN组 |
7 |
-10.92±2.46** |
0.69±0.38* |
KLN适用于辨证属心阴虚、心火旺的快速性心律失常患者。
杨传华教授认为，心阴虚、心火旺、心神不安则致心脉失调、心中悸动不安，是快速型心律失的主要病机。
KLN方中黄连、生地为君，苦参、当归为臣，泻补结合，清心火而无损心阴，滋心阴而不助心火，加入酸枣仁、柏子仁养心安神为佐使，全方药少而精，力专效宏。
IK是心肌细胞主要的复极化电流，主要参与3期复极，呈时间依赖性和电压依赖性，IK的变化直接影响到动作电位时程(APD)和有效不应期(ERP)的长短，是目前常用的Ⅲ类抗心律失常药物的主要作用靶点，一直备受关注。
本实验表明，KLN对IK具有剂量依赖性抑制作用；尾电流包裹程序中，KLN可剂量依赖性抑制IK，tail，使电流密度-时间关系曲线下移，而IK，tail为较纯净的IK的重要标志，因而再次印证了其对IK的抑制作用。
目前认为IK具有快速激活型(IKr)、缓慢激活型(IKs)和超快速激活型(IKur)3种成分或亚电流。
IKr激活及失活迅速，而IKs激活缓慢，没有失活。
因此，+50 mV刺激时随时间缓慢增大的外向电流成分主要为IKs，可判断KLN对IKs的作用。
IKs在人心室动作电位复极化中起关键作用，由KCNQ1(Kv7.1)编码的成孔α亚基和KCNE1编码的β亚基形成。
IKs的激活幅度对调节3期复极过程具有重要意义，抑制IKs可减轻心率加快时IKs电流的累积效应，使药物作用随着心率增快而更加显著，在治疗快速性心律失常方面更为理想，且致心律失常风险相对减小。
当然，IKr也在很大程度上促进了复极过程，目前应用的索他洛尔、多非利特均能高度选择性的抑制IKr，但若仅仅抑制IKr则不能对抗IKs的蓄积性激活作用，反而可能出现IKs的上调，而且存在反向使用依赖性。
本研究已经证实KLN对IKs的作用，在今后的研究中将进一步评价KLN对IKr的作用。
IK1是内向整流钾通道基因 Kir2.x 亚家族成员构成的异源性四聚体，是抗心律失常药物作用的另一靶点。
IK1是心肌细胞重要的背景外向电流，维持心肌细胞静息电位，同时IK1也参与复极过程，在动作电位3期的后1/3段，其它离子流大多处于失活状态，而IK1的外向电流却在增大，从而加速并最终完成复极化过程。
IK1的改变会导致多种心律失常，国内外多项研究表明抑制IK1可起到抗心律失常作用。
本实验结果表明，10 mg/mlKLN 可以显著抑制IK1外向电流，5及10 mg/ml的KLN均可抑制IK1内向电流。
抑制IK1的外向电流成份，可使心肌细胞膜3期复极化速率减慢，尤其是终末相斜率变大，可延长APD及ERP而起到抗心律失常作用。
同时，实验表明KLN对IK1的作用相对较弱(与IK相比)，起效剂量也较高，考虑由于IK1是工作心肌细胞静息电位产生和维持的主要离子通道，对于维持最大舒张期电位极为重要，因此KLN 的这一作用特点可能反而有利于稳定静息电位，使药物作用更加安全
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