蛋白互作结合力弱？瞬时结合？蛋白质组学新方法各个击破

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获实验小妙招、信号通路解析、科学研究进展

简要：蛋白质互作或蛋白亚细胞定位可利用邻近标记技术来克服传统IP-MS方法中结果准确性不高的问题。CST的PTMScan® Anti-Biotin Kit #41343所用单克隆抗体的稳定性、特异性和无偏性好。针对肽段水平的富集，结合CST科学家对整体实验方案的优化，能明显提高邻近标记技术鉴定后的肽段检出水平，更好的服务于蛋白互作和亚细胞结构定位等的实验目的。

免疫共沉淀（co-IP）是研究蛋白相互作用最常用的方法。免疫共沉淀后通过质谱分析复合物组成也是被广泛应用的方法。但传统的IP-Mass Spec方法进行鉴定有非常多的限制：比如，对瞬时结合蛋白、和弱相互作用蛋白的研究就在很大程度上取决于蛋白裂解液和洗涤条件，会有假阴性。而且若希望对特定亚细胞组分中蛋白复合物进行研究，前期的蛋白分离也至关重要，往往也会得到不稳定的实验结果。

邻近标记技术

APEX或BioID等在活细胞中进行邻近标记是一种新兴技术，可用来确定蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质亚细胞定位[1-3]。 与传统的免疫共沉淀方法相比，这类新的方法假阳性率低，而且使针对弱的蛋白间相互作用和瞬时蛋白相互作用的检测成为可能。

图1. APEX邻近标记技术概述。步骤1.共表达目的蛋白与APEX过氧化物酶。步骤2.通过添加生物素酚和H2O2诱导生物素化反应。步骤3.在反应性生物素酚的作用下，对邻近的互作蛋白进行标记。化学反应原理在下图进行了描述：蛋白质酪氨酸侧链带有的苯酚基团被生物素酚所标记。

这类生物素标记结合LC-MS/MS分析方法实际已广泛用于高通量分析的研究，包括：蛋白质翻译后修饰，细胞表面蛋白，蛋白间相互作用和蛋白质亚细胞定位。 直接研究蛋白质生物素化位点仍较困难，因为用传统方法，基于（链霉）亲和素纯化，有回收得率低的缺点。抗生物素抗体相比（链霉）亲和素而言，可能是更好的生物素化肽段捕获试剂。 本文所述研究中，我们使用新的抗生物素兔单抗建立了免疫亲和富集方法，并与两篇已发表论文中使用的其他供应商的多抗进行了比较。然后利用这套方法，针对活细胞APEX邻近标记的样本，进行了生物素化位点的富集研究。

图2：传统和新的蛋白质生物素化识别方法概述。传统方法应用（链霉）亲和素微珠纯化生物素化的蛋白质，背景蛋白在变性条件下被洗掉，生物素化蛋白被保留在微珠上，并经过蛋白酶消化。然后非生物素化的肽段被洗脱并进行LC-MS / MS分析。新兴方法侧重于鉴定生物素化的肽。首先，所有蛋白被消化成肽，然后生物素化的肽被微珠结合的抗体捕获。纯化生物素化肽的优势有：可以确定生物素化位点；并且通常由非特异性结合蛋白和天然生物素化蛋白造成的假阳性能得到更好控制。选择正确的捕获试剂是肽段水平纯化的关键。可用的试剂主要有两种（虚线矩形）。在2014年，Schiapparelli等人描述了一种使用中性亲和素（一种去糖基化的亲和素）富集生物素化肽的方法 [4]。在2017年，Kim等人 [5] 和Udeshi等人 [6] 报告了基于抗生物素抗体富集生物素化肽的方法。相对中性亲和素而言，抗生物素抗体是对生物素化肽更优的捕获试剂，因为它对生物素的亲和力较低，可促进生物素化肽段更高效的洗脱。

方法

用EZ-link NHS-Biotin 标记胰蛋白酶消化的小鼠肝脏的肽段，作为测试对照样品用于优化方法。HEK 293T细胞稳定表达β2AR和APEX的融合蛋白，并同生物素酚共培养，并用激动剂BI处理10分钟，通过添加H2O2诱导蛋白质生物素化。收细胞并用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶肽通过结合了抗生物素抗体的微珠进行免疫纯化。从微珠上洗脱生物素化的肽，脱盐，最后在Thermo Scientific Q Exactive或Fusion Lumos上进行分析。生物素化肽段通过Sequest搜索进行鉴定，并用Skyline进行MS1无标签生物素化肽的定量。

结果

方法比较实验包括免疫沉淀和LC-MS /MS，主要利用生物素标记的小鼠肝脏肽段。本文比较了不同的抗生物素抗体和实验方案对结果的影响。我们建立的方法能得到平均3425（±227）条独特的生物素化肽，文献中的方法能得到3245±88、1425±129和193±20条生物素化肽。

图3.用于生物素化肽段鉴定的不同抗生物素抗体的方法比较。将1μg小鼠肝脏化学生物素化的肽段与1 mg未处理的小鼠肝脏肽段混合。生物素化肽段通过不同的抗生物素抗体富集后，用Orbitrap Q Exactive分析， MS / MS谱图利用SEQUEST检索。使用的市售多抗与不同文献报道所使用抗体一致，另比较了采用CST兔单抗（A7C2A）的免疫沉淀方案。（CST IP步骤：1.用1X PBS洗涤抗体微珠偶联物4次；2.在4度下将抗体微珠与肽一起孵育2小时；3.用1X IAP缓冲液洗涤两次，然后用去离子水洗涤3次；4. 用80％ACN / 0.2％TFA洗脱生物素化的肽）。

表1：多克隆抗体和单克隆抗体的比较

图4.针对生物素化肽的不同富集试剂的比较。将1μg小鼠肝脏化学生物素化的肽段与1 mg未处理的小鼠肝脏肽段混合。生物素化肽段通过NeutrAvidin或抗生物素抗体（A7C2A）富集后，用质谱分析。

图5. 肽段基序分析：使用从所有化学生物素化的小鼠肝脏肽段中富集并鉴定出的生物素肽段。赖氨酸残基（左/上）和肽段的N末端（右/下）的基序标签表明抗生物素（A7C2A）抗体通用性较高，识别生物素修饰且未显示识别序列偏好性。

实用性示范实验中，利用重组抗坏血酸过氧化物酶（APEX）系统鉴定同HEK293T细胞中β2AR相互作用的蛋白。我们建立了一种方法，富集探索被APEX过氧化物酶标记生物素后的肽段，这些肽段来源于在HEK293T细胞中与β2AR邻近蛋白质，通过质谱鉴定能得到这些邻近蛋白的生物素化位点。

图6.用Anti-biotin (D5A7) Rabbit mAb #5597进行WB检测重组β2AR和APEX蛋白邻近标记的生物素化蛋白。培养β2AR-APEX细胞并用100nM的β2AR激动剂BI处理10分钟。通过添加生物素酚和过氧化氢，用生物素标记未处理的细胞和处理的细胞。一盘细胞未经H2O2处理用作对照。反应最终被淬灭，并通过尿素缓冲液提取蛋白质。 WB实验表明观察到的蛋白质生物素化直接来自于邻近标记。

图7. 基于CST抗生物素抗体（A7C2A）富集肽段与文献[1]里基于链霉亲和素的富集蛋白方法的结果比较。使用材料均为培养的β2AR-APEX共表达HEK293T细胞。

图8.使用从β2AR-APEX细胞中鉴定出的所有生物素化肽进行的基序分析。图案徽标酪氨酸残基检测结果表明抗生物素（A7C2A）抗体是一种通用的生物素抗体，可识别生物素修饰，并且没有表现出明显的序列偏好。

总共鉴定并定量了1354种独特的生物素化肽段，这些肽段来自于858种蛋白质。其中，来自125种蛋白的148种生物素化肽段含量，在激动剂处理前后发生了明显变化（倍数变化≥2.5）。

图9.从BI处理和未处理的β2AR-APEX稳定表达细胞中鉴定出的生物素化肽的相对丰度。上图显示共有858个蛋白质的1354个独特的生物素肽段在抗生物素抗体（A7C2A）富集中被鉴定并定量。其中，125个蛋白的148种生物素化肽段水平随激动剂的处理发生了显着变化（≥2.5）。上表举例了相应的生物素化肽段和处理前后的变化，也对比了Paek研究[1]中的结果。注：文献数据基于蛋白水平，我们在此假设肽段变化趋势同其对应蛋白一致。

研究新颖性

我们阐述了一个强大而性能良好的免疫富集生物素化肽的方法。

结论

1.使用抗体纯化生物素化肽的新兴方法优于传统方法基于（链霉）亲和素富集生物素化蛋白的方法。来自Cell Signaling Technology（CST）的兔单克隆抗生物素抗体（A7C2A）显示出优势，优于其他市售的多克隆抗体和NeutrAvidin试剂。

2. CST的抗生物素抗体（A7C2A）可用于鉴定生物素化的肽段，并确定APEX邻近标记细胞中的蛋白质结合伴侣。此外，它可用于蛋白质生物素化位点的任何其他大规模研究，例如蛋白的翻译后生物素化修饰的研究，和生物素标记的细胞表面蛋白的分析。

*PTMScan® Anti-Biotin Kit #41343包括PTMScan® anti-biotin（A7C2A）免疫亲和微珠，PTMScan®IAP缓冲液。它能帮助客户自行进行生物素化肽段亲和纯化

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致谢

我们感谢哈佛大学医学院生物化学和分子药理学系Andrew Kruse教授提供β2AR-APEX稳定表达的HEK293T细胞系和BI配体激动剂。