Nature：lncRNA竟然不依赖于序列起作用！

本期的Nature 前后三篇文章共同聚焦LncRNA的作用，让我们快来一起学习吧

长非编码RNA通过非序列依赖的模式增强临近基因转录

哺乳动物基因组广泛转录出数千个长非编码RNA（lncRNA）。这些lncRNA中的一些已经显示通过RNA-蛋白相互作用募集调节复合物以影响附近基因的表达，并且目前很多研究也提出，许多其它lncRNA也可以作为局部调节剂。这样的局部功能可以解释lncRNA表达常常与附近基因的表达相关的观察结果。然而，这些相关性正在日益接受挑战，并且可能替代地从不是由lncRNA转录本身介导的过程产生。

例如，已经提出一些基因启动子具有作为增强子的双重功能，并且转录本身的过程可通过募集激活因子或重塑核小体而有助于基因调节。科学家使用小鼠细胞系中的遗传操作来解剖产生lncRNA的12个基因组座位，发现这些座位中的5个影响顺式中相邻基因的表达。值得注意的是，这些效应都不需要特异性的lncRNA转录物本身，而是涉及与其生产相关的一般过程，包括基因启动子的增强子样活性，转录过程和转录物的剪接。此外，这样的效果不限于lncRNA基因座：他们发现六个蛋白质编码基因座中的四个也影响邻居的表达。这些结果表明相邻基因之间的串扰是一种普遍的现象，可以涉及多种机制和顺式调节信号，包括RNA剪接位点的作用。这些机制可以解释产生lncRNA的一些基因组座位的功能和进化，并广泛地有助于调节编码和非编码基因。

科学家们选择在小鼠胚胎干细胞（mES细胞）中分析了12个lncRNA基因位点，这些lncRNA优先定位到细胞核，并跨越一系列丰度水平。

对于每个基因座，科学家通过使用基于经典顺 – 反测试的遗传方法寻找对局部基因表达的直接调节作用。具体来说，首先产生携带启动子（〜600-1,000-bp缺失）的杂合敲除的克隆细胞系，并比较在顺式和反式等位基因的1 Mb内的附近基因的表达（即，和未修饰的同源染色体）。仅涉及顺式等位基因的邻近基因表达的改变很可能是由lncRNA基因座的直接局部功能引起的，而涉及顺式和反式等位基因的改变可能作为lncRNA在其它地方起作用的间接下游结果。我们在129 / castaneus F1杂交mES细胞中进行遗传修饰，其含有每〜140bp的多态性位点，使得我们能够使用RNA测序来区分两个等位基因。

具体来看，对于linc1536这个基因，有两个等位基因，129和cast，一个简单来区分直接距离作用和反式作用的话，就是通过Cas9切开一个等位基因染色体，而另外一个不变，如果是反式作用，则无论切哪个染色体，如果跟下游的Bend4基因是反式作用，则Bend4两个等位基因都会下降。而如果是顺式发生作用，则只有被切的染色体，对应的下游的bend4基因会发生变化。

在这12个lncRNA基因座中的5个，启动子敲除以等位基因特异性方式显着影响附近基因的表达（假发现率<10％），包括激活和抑制作用。对于每个基因座，受影响的基因位于紧邻敲除的启动子（图1c和扩展数据图4）的5-71kb内。这表明大部分的lncRNA基因座影响相邻基因的表达。

为了测试这些作用是否特异于lncRNA基因座，科学家们删除了六个蛋白质编码基因的启动子。令人惊讶的是，在这些位点中的四个位点的敲除也影响邻位在顺式中的表达。因此，非编码和编码基因座都可以直接影响局部基因表达。这些调节连接可能有助于观察到的邻近基因的表达的相关性。

那么lncRNA具体是通过什么样的机制来调节邻近基因的表达？

因为在这些实验中科学家删除了基因启动子，基本上这种顺式作用的机制可以原则上涉及（i）基因启动子中的DNA调控元件（ii）转录过程（iii）RNA转录本身。 为了开始区分这些可能的机制，科学家在每个转录起始位点（TSS）下游插入了0.5-3kb的早期多腺苷酸化信号（pAS），其消除了大多数RNA的产生，同时保持启动子序列完整。 科学家们审查了四个启动子删除影响邻近基因的表达的lncRNA基因座和两个mRNA基因位点。

作为一个实例，科学家们具体描述linc1536基因座，下文称为Bendr（不依赖于RNA的Bend4调节作用）。 删除Bendr启动子将相邻Bend4基因的表达减少57％，将pAS插入Bendr的第一内含子（在〜13kb基因座中TSS的下游约570bp）对Bend4表达没有影响。这种效应似乎是由约750 bp敲除启动子近端区域中的DNA调节元件介导的。

因此，极有可能lncRNA的启动子作为转录的增强子发挥作用。

此外科学家们还确定了一个基因座，linc1319（重命名Blustr，其中启动子删除和pAS插入大大减少邻近基因Sfmbt2的表达。为了详细了解调节机制，科学家们测试了Sfmbt2的激活是否由Blustr转录物的序列特异性功能介导的（例如，染色质状态或辅因子的募集）。为了测试第一种可能性，他们敲除了三个下游外显子和三个内含子中的每一个。这些缺失都没有削弱Sfmbt2激活，表明Sfmbt2的激活不需要在Blustr转录本中的独特序列或结构。为了测试第二种可能性，科学家们在第一外显子或内含子（TSS的+ 40bp至+ 15kb下游）的五个不同位置处设计了pAS插入，并发现增加Blustr转录区的长度导致Sfmbt2的活化增加。我们注意到，改变转录区域的长度影响在Blustr基因座中的聚合酶的总量。因此，Sfmbt2激活响应于在Blustr基因座中的转录活性的长度/量的变化，但似乎不需要成熟Blustr转录物中的特定序列元件。

因为启动子 – 近端剪接位点和剪接过程可以增强转录， 在一些情况下，多达100倍。科学家们测试了Blustr的剪接是否涉及Sfmbt2激活。在删除Blustr的第一内含子的5’剪接位点时，观察到Blustr转录减少94％（如通过GRO-seq测定），成熟Blustr的水平降低92％转录物和Sfmbt2表达减少85％，表明Blustr的第一个5’剪接位点在激活Blustr和Sfmbt2转录中具有关键作用。相比之下，下游剪接位点是不必要的：在删除下游Blustr外显子时，剪接跳过去除的外显子到下一个可用的3’剪接位点，并且Sfmbt2表达不受影响。

总之，这些数据表明5’剪接位点和在Blustr基因座中的转录过程对其调节Sfmbt2的能力是重要的。这表明Blustr RNA事实上是Sfmbt2激活所需的（剪接涉及剪接体和新生转录物之间的直接相互作用），尽管这种机制似乎不依赖于在初始剪接信号存在之外的RNA的精确序列。一种可能性是5’剪接位点促进Blustr基因座中的转录活性，其继而募集作用于附近的Sfmbt2启动子的转录机制的组分。与该模型一致，改变Blustr基因座中的转录或剪接导致Sfmbt2启动子处的染色质状态的改变（包括H3K4me3的减少和H3K27me3的扩展），并且减少了在Sfmbt2TSS下游的暂停位置中接合的RNA聚合酶的占据（。因此，Blustr转录和剪接的变化可以通过改变Sfmbt2启动子处的染色质状态和RNA聚合酶占据部分地影响Sfmbt2表达。

总结：

eric Lander等人的研究揭示了，lncRNA这些功能似乎代表哺乳动物基因调节网络的基本性质。 这些顺式调节连接的性质（包括特异性的机制和基因激活的潜力）代表未来研究的关键领域。