Southern Blot原理及实验方法

大家好，欢迎来到IT知识分享网。

关注我们，了解更多内容

原理

将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途

检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。

实验试剂· 器材

试剂

• 变性液：1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH
• 中和液：0.5mol/LTris-HCl(pH=7.0)，1.5mol/LNaCl
• 20×SSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠。以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
• 2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL
• 6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL

器材

22cm×15cm瓷盘

• 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。

• 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
• 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
• 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
• 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
• 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。先把它放在去离子水中润湿后，再放在20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，两层之间不可有气泡。
• 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜上，同样要把气泡赶走。
• 把一叠吸水纸（或卫生纸，约有5—8cm高，略小于滤纸），放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。
• 转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。
• 把已转移了DNA的硝酸纤维膜放在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液。再把它夹在两层滤纸之间，80℃真空干燥2小时。

注意事项

• 将凝胶中和至中性时，要测pH,防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
• 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。

SDS-PAGE电泳注意事项

• SDS与蛋白质的结合按质量成比例，蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。（即：1.4gSDS/g蛋白质）
• 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10％误差，不可完全信任。
• 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。
• 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。
• 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

End