PCR反应基础3-引物设计

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对于DNA聚合酶链式反应（PCR），《分子克隆实验室指南》第三版及第四版都有专门的一章来介绍，任何人只要认真阅读了这些内容，凭自己的理解能力，均可以获得足够日常应用的知识了。

对于PCR引物设计，在Methodsin Molecular Biology系列专著中，已经有402及1275两本专门用来论述PCR引物设计，而相关文献也是海量的，稍微搜索一下就可以找到这些资料。

在此，Master P不欲多做更多的抄录工作。只是想提供一个自己的思考角度，以求能启发到有心于引物设计的朋友。

• 引物设计的终极目的

肯定是特异地、高效地扩增出目的片段。

尽管PCR是体外DNA扩增的高效方法，但是仍会有一定失败的风险，或者不够完美的地方。

第一当属保证扩增特异性。在这里，特异性指的是扩增出设计初衷想要扩增的片段，而不扩增出其他片段。这样避免假阳性，同时也方便下游实验操作，比如想要回收纯化扩增产物，单一条带的显然要比有非特异条带的要省时省力。

而高效也是保证能够扩增得到足够的DNA。当然高效和特异并不是相互矛盾的双方，通常特异性好的，扩增效率也会更高些。

• 引物设计的原则来源于哪里？

那些原则，必然是来自物质本身的性质。Master P前期撰文论述了各类DNA聚合酶，又特别加入一篇关于核酸退火的文章，就是想要引申到这个核心本质上。

Primer本身是一段寡核苷酸，它的热动力学规律和普通核酸无本质上的区别。假如一个人之前是研究分子杂交的，那么当他来学习PCR引物设计的时候，也会像学会了九阳神功之后的张无忌学乾坤大挪移一般，So easy!即使张爸殷妈都不在了，照样不用担心学习。

在引物设计上，最重要的就是要考虑到设计好的引物在PCR体系内，是不是work。实际经验中，不少实验者浪费了三五天仍不能完成扩增，转而怀疑试剂生产商提供的产品质量问题，其实很多只要稍微改变引物设计就能解决了。“工欲善其事必先利其器”，“磨刀不误砍柴工”,为何要在几次失败的实验之后，才能回头来增进自己关于PCR，引物方面的知识呢？

• 说到利器，那么在引物设计领域，有什么真正的利器呢？

引物设计软件很多，目前普遍在用的Primer 5，Oligo等，都不是免费的。而在线的引物设计工具也不少，如NCBI的Primer BLAST，Primer3这两个。还有一些专业性更强的工具，不过这种比较难寻找，不是百度几下就可以成功，可能需要更多“努力”才能安装好。Master P个人的经验是，没有哪一种软件能满足全部的引物设计需求，如果条件允许，最好学习使用两种以上的设计软件。

在此，Master P列出个人认为的比较实用的设计原则：

• 理想地，引物长度在19-24碱基之间，这些碱基均与模板严格配对
• PCR反应中，引物Tm值匹配远比引物长度相当重要
• 3`端存在错配相当有害的（fatal）
• 5`端可以适当的带一些与模板不匹配的碱基（overhang）
• 引物序列应严格检查以确保无分子内的互补反向重复序列。
• 每条引物应该检查以排除3`端存在互补的情况。
• 引物中的GC含量不宜过高
• 引物应设计为四种碱基均衡分布在序列内，避免某种或某类集中一处
• 重复序列应以避免
• 在3`端，G+C在最后5个碱基中数量不宜超过两个。
• 在3`端，最后一个碱基是G或者C能够提升PCR效率。

在之前的六小龄童“中美合拍新西游，文体两开花”成为论坛风潮，有网友根据其微博博文总结出人类的本质之一“复读机”。而在“权力的游戏“中，Sam Tarly离开学士城之时不无感慨”I`m tired reading aboutthe achievements of better men”.

Master P不想做复读机，又何尝不曾厌倦了一直在阅读优秀人的智慧结晶，而苦于自我价值无处可寄托呢？一等的人创作，二等的人阐述，二者哪个更重要一点呢？当古希腊文明的成果在中世纪的黑暗中奄奄一息，是新兴的阿拉伯“作家”们在翻译、整理、保存那些成果，客观上为文明的发展做出了重要的贡献。

每想到此，Master P便多了一份在文献海洋中浮游的勇气。