默克生命科学实验分享 | PCR/qPCR数据分析

大家好，欢迎来到IT知识分享网。

PCR/QPCR定性数据分析

传统的PCR完成后，会通过琼脂糖凝胶——最近更常使用的是毛细管电泳系统——来分辨并分析数据。在某些应用中，例如SNP基因分型，将使用用于分析的端点数据来运行qPCR。在每一种情况下，端点数据都将在PCR达到平台期后提供定性分析。在某些情况下，有可能分析端点数据以对PCR产量进行半定量分析，但更多时候则使用qPCR并对定量循环值 (Cq)1进行分析以进行定量测定。更多qPCR数据相关内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn

本指南中，重点强调了使用PCR或qPCR测定核酸时，导致变化产生的因素。为了使得到的测定结果最大可能地接近于反应中基因（靶点）的实际数量，应对每一个因子进行优化。 这些优化过程会为每个样品中的每个靶点生成一组Cq值。本章介绍了推导和分析这些Cq值从而得到可以代表生物学情况的可靠数据的过程。

基线校正

确定每个样品中每个靶点的Cq值。不同的分析方法结合不同的仪器，采用不同的途径来确定Cq（并且也使用不同的名称，例如，Ct、Cp、出发点）。对所有这些算法的深入研究不属于本指南的范围。然而，基于扩增曲线的qPCR测定对背景荧光敏感。背景荧光可能由一系列因素引起，包括塑料器皿的选择、未被淬灭的剩余探针荧光、泄漏到样品孔中的光以及对给定微量滴定板的光学检测的差异。在设计良好的测定中，与扩增信号相比，背景是比较低的。但是，背景信号的变化可能妨碍不同样品的定量比较。因此，校正导致基线差异的背景荧光变化是非常重要的（图10.1）。

图 10.1扩增曲线的组成。该图显示了不同样品中，荧光随循环数增加而增加。阈值设置在检测限以上，但远低于扩增速率放缓的平台期。

通常使用早期几个循环（如第5到第15个循环）的荧光信号强度来确定背景荧光的一个恒定线性部分。然后将其设置为扩增曲线的背景或基线。由于瞬时效应，最开始的几个循环（如第1到第5个循环）通常会显示出反应稳定的假象，因此建议在基线定义中将其避开。在基线校正中使用越多的循环，则基线变化的线性部分的潜在准确性越高。很多设备的软件包都允许人工设置用于基线定义的循环数。用户应该探索这些功能，抵制接受默认设置的诱惑。

图10.1是一个基线设置的效果示例。如图所示，Cq值和扩增曲线的形状受到精确的基线设置的影响。该示例中，标注为C3的曲线的基线被错误地手动调节，从而使得第5到第31个循环的数据被用于基线的计算。这导致曲线下降到零基线水平以下（图10.2A），同时Cq值为28.80。为了改正错误，查看原始数据R，确认线性背景的最后一个循环（扩增前的最后一个循环）。从图10.2B可以看出，这是第22个循环。在第5和第22个循环之间，基线被正确设置为零（图10.2C），随后扩增曲线也被校正（图10.2D）。校正后的Cq值为26.12。因此，正确和不正确的基线设置会导致Cq值的显著差异，由此证明，设置正确的基线是数据分析的一个重要组成部分。

图 10.2A–B. A)当基线设置不正确时，数据落入标准化荧光读数零点以下的典型示例（蓝色扩增曲线）。B) 同一个扩增曲线的原始数据显示了基线的线性范围并且该数据没有出错。

图 10.2C–D. C)使用适当的软件设置来定义基线的起始和终止范围。D) 应用经校正的基线设置可以得到高质量的数据

虽然一些研究者提倡绘制单独的扩增曲线来估计测量样品的扩增效率和靶点数量2,3,4，但最早和最常见的推导Cq的途径是使用阈值。阈值法是一种简单、高效的定量方法，因而被广泛使用。

阈值法的原理是，为了使得qPCR扩增相关的荧光信号可视化，信号必须增加直到超过仪器的检测限（基线；见图10.1）。达到这一点需要的循环数与样品中靶点的起始拷贝数成比例。因此，如果原始拷贝数低，则信号增加到超过基线需要的循环数就多，而如果拷贝数高则循环数就少。由于基线设置为系统的检测限，因此基线处的测量结果将会非常不准确。因此，在测量时会选择更高的荧光强度并引入人工阈值，而不是系统可以检测到的最低的荧光强度。

阈值强度的选择需要遵守几个基本原则。对于给定的靶点和其他用来比较的样品，将阈值设为固定强度是很重要的。如果在同一个平板上有太多样品，则需要采用板间校准方案，例如，包括用作板间参照或者标准曲线的连续稀释的重复参照。理论上，阈值可以设置在扩增曲线对数线性期的任意位置。但是，实际应用中，扩增曲线的对数线性期会受到很多因素的干扰，如背景荧光基线漂移、平台期或者由于测定效率的不同导致的扩增曲线在较高循环时斜率的不同。建议按以下条件设置阈值：

• 阈值需设置得足够高于背景荧光基线，确保避免由于背景荧光而导致扩增曲线过早地超过阈值。
• 阈值需设置在扩增曲线的对数期，以避免受到平台期的影响（在对数图上观察扩增曲线最容易发现这一点，图10.3A）。
• 阈值需设置在所有扩增曲线的对数期平行的位置。

阈值设置过程如图10.3所示。在图10.3A中，对数曲线的Y轴为对数刻度，从而将扩增的对数期进行视觉扩展，呈现为扩增曲线的一个线性部分。阈值设置为最高的荧光强度（参考Y轴），位于对数期且该位置上所有的扩增曲线都是平行的。然后将刻度返回到线性视图（图10.3B）以显示满足阈值设置要求的最高设置。或者，可以将阈值设置在对数期的较低端（图10.3C和10.3D）。只要扩增曲线的对数期是平行的，样品之间的ΔCq 就不会受到阈值设置的影响。

图 10.3阈值设置会影响记录的绝对Cq ，并可能影响样品间的ΔCq 。A).使用对数vs线性图分析数据，阈值设置为扩增曲线平行对数期上的最高荧光强度。 B).阈值设置同A）但显示为线性vs线性图。C).使用对数vs线性图分析数据，阈值设置为扩增曲线平行指数期上的最低荧光强度。D).阈值设置同C）但显示为线性vs线性图。在每种情况下，样品间的ΔCq 值是相同的。

当分析包括较高循环的数据时，为了更高的相关性，阈值被要求设置在扩增曲线平行的对数线性期上。对更高Cq的数据集，重复之前描述的针对图10.3中数据的阈值设置程序，结果见图10.4。表10.1中得到的 Cq数据显示了Cq的变异性，以及更重要的，显示了三种阈值设定的三个扩增曲线的ΔCq 值（图10.4）。由于扩增曲线不是平行的，ΔCq 值和由此对每个样品中靶点相对数量的估算极大地依赖于阈值的设置（图10.4）。

QPCR定量策略

正确的基线和阈值设置对于可靠的定量而言是必需的。设置完成后，可生成一个Cq值并将其作为定量的基础。然后使用标准曲线或相对/比较定量来确定指定样品中的靶点数量。

顾名思义，标准曲线定量需要使用标准曲线来确定测试样品中靶点的数量。因此，为样品确定的数量与标准曲线指定的数量相关。这就需要在每组样品反应的同时运行额外的外部标准。为了消除由于样品和标准品的测定效率不同而造成的潜在的定量差异，应慎重选择用于标准曲线的材料。外部标准的引物结合位点必须和靶点的相同，含有和靶点相同的序列，有相似的复杂性，并且处理方式尽可能相似。因此，当测定cDNA中的靶点浓度时，优先选择在对照样品的连续稀释液中测量相同的cDNA。但是，在一些研究中，实际条件无法做到这一点，因此，需要尽可能的再现样品的条件，例如，将来自与测试物种无关的物种的gDNA加入人工寡核苷酸标准或携带标准序列的线性化质粒中。一旦鉴定出合适的构建体或扩增子，就可以生成一条连续稀释的标准曲线。确定每个标准对应的靶点的Cq值，并与对应的浓度或相对浓度/稀释因子的对数作为坐标轴作图。由此得到标准曲线，从而可以通过比较未知样品扩增后的Cq值，得知测试样品的浓度。当使用标准曲线定量时，阈值必须保持恒定以确定同一平板上标准品和样品的Cq值。不同平板间的阈值可能会不同。

相对或比较定量根据不同样品中靶点序列Cq值的差异来确定其浓度的差异。该方法不是像标准曲线法那样测定每个样品中靶点的数量，而是得到一个数据集以显示样品间的倍数变化。

在该途径5的原型中，假定所有测定的效率都是100%，从而假定当结果为靶点的2倍差异时，Cq的差异为1 (ΔCq = 1)。为了确定靶点或者目的基因（GOI）的倍数变化，数据必须加入对照（参照基因，参考；请参阅随后的关于数据标准化的讨论）用于参考。

图 10.5.标准曲线的建立。对于稀释系列中每个样品记录的Cq值，使用对数线性坐标对相对浓度作图。

在等式1中，两个样品（A相对于B）中，经过校正的GOI与参照基因的比值按如下方法计算：以2（假定反应效率为100%）为底数，两个样品GOI的Cq值的差异作为指数，进行幂运算，除以2为底数参照基因的Cq值差异为指数的幂。

但是，如测定的优化和验证中所示，反应的效率相差悬殊，对数据有很大影响。因此，对等式1中的假设进行处理（等式2）6，将反应效率的差异纳入分析中。在这种情况下，扩增因子2被PCR的实际效率（使用标准曲线测定；参见测定的优化和验证）所取代。

这是一个简单的研究范例，测定两个样品中同一种基因的倍数差异以及经过单个参照基因标准化后的倍数差异。比值表示为经过单个Ref基因校正后样品2中GOI相对于样品1的倍数差异。但是，显而易见的是，选择一个单独的合适的参照基因通常是不可能的，因此，研究者建议使用更复杂的方法来进行标准化。